Adenovirusvaccine indeholdende trunkeret SARS-CoV-2 Spike Protein S1-underenhed fører til et specifikt immunrespons i mus

AbstraCT:Udviklingen af ​​en effektiv og sikker vaccine mod coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er en afgørende tilgang til håndtering af den alvorlige akutte luftvejssygdom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi i lyset af de nuværende forhold. I denne undersøgelse producerede vi et forkortet segment af det optimerede SARS-CoV-2 spike-gen (2043 bp, kaldet S1), der var i stand til at kode for et trunkeret S1-protein. Proteinet blev testet for at bestemme, om det kunne fremkalde effektiv immunisering i mus mod SARS-CoV-2. Tilstedeværelsen af ​​S1-proteinet blev bekræftet med immunfluorescens og Western blotting. En adenovirusvaccine, der bærer S1-genfragmentet (Ad-S1), blev administreret intramuskulært til mus fire gange i løbet af 4 uger. SARS-CoV-2 S1-proteinhumoral immunitet blev påvist i alle immuniserede mus. Serumet fra immuniserede mus udviste fremragende anti-infektionsaktivitet in vitro. Et robust humoralt immunrespons mod SARS-CoV-2 blev observeret hos musene efter vaccination med Ad-S1, hvilket tyder på, at adenovirusvaccinen kan hjælpe med udviklingen af ​​vacciner mod SARS-CoV-2 og andre genetisk distinkte vira.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nøgleord: SARS-CoV-2; vacciner; adenoviral vektor; S1-gen; immunitet

1. Introduktion

Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) er ofte forbundet med multipel organsvigt og høje dødelighedsrater [1] og udgør en stor trussel mod offentlig sikkerhed på verdensplan. Fra den 15. juli 2022 har COVID-19-pandemien varet ved globalt, med 557.917.904 bekræftede tilfælde, herunder 6.358.899 dødsfald, rapporteret til Verdenssundhedsorganisationen (WHO). Ydermere er i alt 12.130.881.147 vaccinedoser blevet administreret pr. 11. juli 2022. Derfor er design og udvikling af nye coronavirus (nCoV)-vacciner af stor betydning og en af ​​de øverste globale sundhedsprioriteter. S-proteinet er en nøglefaktor i indtrængen af ​​SARS-CoV-2 alvorlig akut respiratorisk sygdom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i værtsceller [2,3]. Proteinet binder sig til værtsreceptoren og tillader virussen at trænge glat ind i værtscellen [4]. N-bundne glycaner stikker ud fra trimeroverfladen og dekorerer S-proteinet i vid udstrækning, hvilket påvirker S-proteinfoldning, humoral immunitet og værtscelleproteasebehandling [5]. SARS-CoV-2 S-proteinet har lavere N-koblet glycantæthed end andre humane patogene coronavirus-inducerede S-proteiner [6]. Derfor kan S-proteinet være stærkt immunogent og er et hovedmål for neutraliserende antistoffer. S-proteinet har tre strukturelle domæner, blandt hvilke S1-domænet er det vigtigste S-proteinoverfladeantigen [4]. På grund af vanskeligheden ved at producere store rekombinante proteiner (det ekstracellulære domæne af protein S er ca. 1300 aminosyrer) og risikoen for antistofafhængig forstærkning (ADE) af infektion, S1 (ca. 700 aminosyrer) og dets receptorbindende domæne (RBD, omkring 200 aminosyrer) betragtes bredt som de mest attraktive potentielle mål for en coronavirus-vaccine [7,8]. Human adenovirus serotype 5(HAdV-C5) er meget brugt i grundlæggende virologi som genterapi og vaccineleveringsvektor [9]. HAdV-C5 har naturlig diversitet og kan parasitere de fleste værter, hvilket danner grundlag for udvikling af dyreforsøg. Rekombinante adenovirusvektorer med replikabilitets- og replikationsdefekter konstrueret ud fra HAdV-C5 er blevet brugt i vid udstrækning i vaccinelevering og genterapi [9,10]. I øjeblikket er adenovira blevet godkendt som vacciner mod akutte luftvejsinfektioner, og der har været mange forsøg med sådanne vacciner, såsom for malaria og HIV-1 [9]. I dette papir beskriver vi en SARS-CoV-2 human replikationsdefekt adenovirusvektorvaccine og dens fremstilling og anvendelse. I denne undersøgelse blev adenovirusvaccinen konstrueret som følger: vektoren var humant replikationsdefekt adenovirus HAdV-C5 med E1- og E3-deletion, skeletplasmidet var rekombinant adenovirus med pBHGlox∆E1,3Cre, pakningscellelinjen var HEK293-celler, og målgenet var det trunkerede S1-proteingen af ​​SARS-CoV-2. S1-proteinekspression i vaccinen blev identificeret ved Western blot og immunfluorescensassays. For at bestemme kvaliteten af ​​immunresponser induceret af de spike-baserede vaccinekandidater, blev post-vaccinationsantistofresponset undersøgt i detaljer. Immunfordelen ved vaccinen blev evalueret med en bindingsantistoftest (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]) og neutralisationsantistoftest. Vores resultater danner grundlag for udvikling og evaluering af COVID-19-vacciner og behandlinger baseret på S1-proteinet.

2. Materialer og metode

2.1. Celler og dyr

HEK293 og Vero E6 abe nyrecellelinjer blev brugt i denne undersøgelse. Begge cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 2 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % penicillin og streptomycin ved 37 ◦C med 5 % CO2 og mættet fugtighed. Tyve C57BL/6 hunmus (6-8 uger) blev købt fra Zhejiang Animal Experimental Center, Zhejiang-provinsen. Musene blev tilfældigt opdelt i to grupper med 10 mus i hver gruppe. Den ene gruppe blev immuniseret (100 µL intraperitoneal injektion) med en Ad5-vektor, der udtrykker SARS-CoV-2-spidsproteinet (Ad5-S) og den anden med PBS (100 µL intraperitoneal injektion) som kontrol. Den totale mængde virus var 5 x 109 VP. Alle mus blev immuniseret med D0/D14 intramuskulær injektion [11,12]. Ved D14 blev der taget perifert blod på 100 µL, serum blev separeret, og den anden injektion blev givet to timer efter blodopsamling. Ved D28 blev blod opsamlet ved retro-orbital punktering, og serum blev separeret. Bindingsantistoffer blev detekteret 3 dage efter hver blodopsamling, neutraliserende antistoffer blev detekteret 7 dage efter hver blodopsamling, og cytokiner blev detekteret 7 dage efter den anden blodopsamling. Alle mus blev aflivet; alle test blev udført i nøje overensstemmelse med "Retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr i Folkerepublikken Kina" og godkendt af Zhejiang Shuren University Ethical Council.

2.2. Vacciner

Alle SARS-CoV-2-stammer, der blev brugt i denne undersøgelse, blev indsamlet fra COVID-19-patienter med samtykke. Statens nøglelaboratorium for diagnosticering og behandling af infektionssygdomme udviklede en adenovirusvaccine (Vero-celle, WuHan-stamme, GISAID-nummer: EPI_ISL_415711) mod SARS-CoV-2 og derefter vaccinen blev fremstillet i en biosikkerhedsniveau (BSL)-kompatibel indstilling. Vaccinespecifikationen er 0,5 mL/dosis og indeholder Tris, NaCl, rørsukker, MgCl2.6H2O, C6H9N3O2, absolut ethanol og SARS-CoV-2 S1-proteinet.

2.3. Rekombinant adenoviruskonstruktion

SARS-CoV-2 S1-proteinsekvensen (nr. QRU91950.1) blev opnået fra PubMed. Ifølge gendegenerationen blev den optimerede kodonnukleotidsekvens, der er egnet til pattedyrcelleekspression, designet ud fra den forudsætning, at aminosyresekvensen af ​​produktproteinet kodet af SARS-CoV-2 S1-proteinet forblev uændret. Den samlede længde var 2043 bp. 50 precursorsekvensen blev syntetiseret med vævsplasminogenaktivator (tPA), og sekvensen kodende for SARS-CoV-2 S1 aminosyre 2-688 og tPA-precursorsekvensen blev ligeret. En Kozak-sekvens og Spel-restriktionssted blev tilføjet foran startkodonet, og Xbal-restriktionsstedet blev tilføjet efter termineringskodonet. Nukleotidsekvenserne af de ovennævnte gener blev syntetiseret og klonet ind i pUC18 af Sangon Biotech for at opnå det klonede plasmid af det syntetiske gen. Den syntetiserede S1-gensekvens og vektor pDC316 blev fordøjet med restriktionsendonukleaserne Spel og Xbal. Målfragmentet og vektoren blev hentet fra gelen og forbundet til dannelse af et shuttleplasmid. SARS-CoV-2-shuttleplasmidet blev pakket med AdMax-adenovirussystemets skeletplasmid pBHGloxd∆E1 og 3Cre ved co-transfektion af HEK293-celler. Den primære virusopløsning blev opnået efter gentagen fryse-optøning og centrifugering, og viruset blev amplificeret og dyrket efter plakoprensning.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Bestemmelse af adenovirustiter

HEK293-celler i godt helbred blev udvalgt og resuspenderet for at fremstille en 5.0 × 105 celler/mL cellesuspension, som blev podet i en 24-brøndsplade (1 ml/brønd) ) og dyrket ved 37 ◦C i et 5 % CO2-miljø. Prøven blev seriefortyndet ti gange, og en fortyndet prøve (0,1 mL) på 10-5 til 10-8 celler blev podet på en 24-brøndsplade . Derefter blev pladerne udsat for infektion ved 37 ◦C med 5% CO2 i 48 timer. Efterfølgende blev dyrkningsmediet fjernet, forafkølet methanol (0,5 ml) blev tilsat, og prøverne blev fikseret ved -20 ◦C i 20 min. Efter fiksering blev prøverne vasket med fosfatbufret saltvand (PBS) og blokeret med 1% bovint serumalbumin (BSA, 0,2 ml) ved 37 ◦C i 1 time. Derefter blev de primære (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) og sekundære (ged pAb til MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) antistoffer tilsat og inkuberet i 1 time, hvorunder PBS blev brugt til vask. Efter inkubation blev en nyfremstillet arbejdsopløsning (0,2 ml) tilsat og inkuberet i 5-10 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev arbejdsopløsningen kasseret, prøverne blev vasket med PBS, og PBS (1 ml) blev tilsat igen. Det gennemsnitlige antal positive celler i det mikroskopiske felt (kat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope) blev beregnet, hvor en gradient med 5-50 positive celler i synsfeltet blev udvalgt og mindst fem områder blev tilfældigt udvalgt til optælling . Antallet af synsfelter i hver brønd på 24-brøndpladen blev beregnet. Derefter blev virustiteren beregnet i overensstemmelse med følgende formel (1):

2.5. Realtids PCR

For at detektere HEK293-celle-mRNA-ekspression efter viral infektion ekstraherede vi mellemliggende RNA i henhold til TRIzol-betjeningsvejledningen (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Total RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol og bearbejdet med RQ1 RNase-fri DNase I (Promega, Madison, WI, USA) for at eliminere resterende DNA. Komplementært DNA (cDNA) blev opnået ved omvendt transkription af det ekstraherede RNA under anvendelse af et PrimerScript™ RT Reagent Kit med gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Japan). DNA-fragmenter blev genereret med de specifikke primere P1 (50 -GGTGATTCTCTTCAGGTTGGA-30) og P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​af målgenet (S1). Genet blev amplificeret med primerne P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30) og P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30) som den interne kontrol (GAPHD).

2.6. Western Blot

Cellelysatet og supernatanten blev adskilt med natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner. Blottene blev visualiseret med Western blot-billeddannelsesudstyr (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kort fortalt blev membranerne overført til TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) med 5 % fedtfrit tørmælkspulver og rystet på en affarvningsryster ved stuetemperatur i 1 time. Membranerne fra forsøgs- og kontrolgrupperne blev fjernet fra forseglingsopløsningen og inkuberet med det primære antistof: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, kat. #40591- T62, Sino Biological, Beijing, Kina)] ved stuetemperatur. De primære antistoffer blev rystet og inkuberet natten over på en affarvningsryster ved 4 ◦C. Blotten blev skyllet med TBST-opløsning og inkuberet i 2 timer med det sekundære antistof [gede-anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) H&L (HRP) (1:10.000, kat. #ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Efter skylning blev blottene inkuberet i 1 min med et LumiBest ECL Substrate-opløsningskit (kat. #4AW011-100, 4A Biotech) og derefter observeret i en billedkamera.

2.7. Immunfluorescensassay

HEK293-celler (3 × 106/brønd) blev podet i 12-brøndsplader. Efter 48 timer blev cellerne inficeret med adenovirus indeholdende S1-genet (Ad-S1). Efter 48 timer blev mediet aspireret, og cellerne blev vasket én gang med PBS indeholdende 2% BSA og fikseret i 15 minutter med methanol, der var blevet forkølet i 15 minutter ved -20 ◦C. Efter tre vaske med 2 % BSA i PBS blev cellerne permeabiliseret med 0,5 % Triton X-100 i 10 min. Derefter blev cellerne blokeret i 1 time med 2 ml 2% BSA, den blokerende opløsning blev kasseret, og cellerne blev vasket tre gange med PBS. Efterfølgende blev 2 mL primært antistof [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] tilsat til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time eller 4 ◦C natten over. Derefter blev prøven skyllet tre gange med 2% BSA i 5 minutter pr. skylning. Derefter blev 2 ml sekundært antistof [gede-anti-kanin IgG H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, kat. #550037, ZenBio)] tilsat til hver brønd og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efterfølgende blev prøverne skyllet tre gange med 2% BSA i 5 minutter pr. skylning. 40,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)-opløsning (2 ml, 1 mg/ml) (1:400, kat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) blev tilsat til hver brønd og reagerede i 10 minutter i mørke. Analysen blev observeret med et EVOS™ M7000 billeddannelsessystem (kat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

SARS-CoV-2 S-protein (1 µg/mL) blev coatet natten over i 96-brøndsplader (100 µL/brønd) med 0. 05 M bicarbonatbuffer. Efter vask med PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, tilsæt vand til 1000 mL) fem gange blev blokerende opløsning tilsat og inkuberet ved 37 ◦C i 1 time. Serumprøven blev fortyndet og tilsat til hver brønd (100 µl/brønd). Efter 1 times inkubation ved 37 ◦C blev prøverne vasket med PBST fem gange. Det primære antistof [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, kat. #40591-T62, Sino Biological)] blev tilsat og inkuberet i 1 time, derefter prøverne blev vasket fem gange med PBST, efterfulgt af 1 times inkubation ved 37 ◦C med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof [gede-anti-kanin IgG H&L (HRP) (1:10.000, kat. #ab6721, abcam)] og fem vaskes med PBST. Efter tilsætning af 3, 30, 5 og 50-tetramethylbiphenylanhydrid i 5 minutter blev reaktionen standset med 2 M svovlsyre. Den optiske tæthed blev målt ved 450 nm og 630 nm med et enzymmærkningsinstrument (Molecular Devices, SpectraMax 190) og derefter tilpasset til en standardkurve.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

2.9. Cytokinbestemmelse 

Pladen (kat. #T-k15048D-1, MSD) blev vasket tre gange med 150 µL/brønd vaskebuffer, og en 50 µL forberedt prøve blev tilsat til hver brønd. Derefter blev pladen forseglet med en klæbende pladeforsegling og inkuberet ved stuetemperatur under omrystning i 2 timer. Derefter blev pladen vasket tre gange med 150 µL/brønd vaskebuffer, og 25 µL detektionsantistofopløsning blev tilsat til hver brønd. Pladen blev forseglet igen og inkuberet ved stuetemperatur under omrystning i 2 timer. Derefter blev pladen vasket tre gange med mindst 150 µL/brønd vaskebuffer; 150 µL 2× Read Buffer T (MSD) blev tilsat til hver brønd, og pladen blev analyseret på et MSD-instrument.

2.10. Neutraliserende antistof

2.10.1. Pseudovirus-neutraliseringsassay

Museserumneutraliseringsaktiviteten blev testet under anvendelse af et pseudoviralt system med vesikulær stomatitisvirus (VSV). Serumet blev inaktiveret i et vandbad i {{0}},5 timer ved 56 ◦C og derefter serielt fortyndet til det påkrævede område. HEK293-celler blev udpladet i en 96-brøndsplade. Det fortyndede serum blev blandet med 200 CCID50 (virusdosis, der kan inficere 50 % af cellekulturen)/100 µL af virussuspensionen i forholdet 1:1 og anbragt i en CO2-inkubator (37 ± 1 ◦C) for 2 timer. Derefter blev 100 µL virusvedligeholdelsesopløsning indeholdende 0,5 % penicillin-streptomycin-dobbeltantistof tilsat til hver brønd, og den neutraliserede blanding blev podet i en 96-brøndsplade indeholdende celler med 100 µL pr. brønd med to gentagne brønde for hver fortynding. Samtidig blev en normal cellekontrol indstillet, og cellerne blev inkuberet i en CO2-inkubator (37 ± 1 ◦C) i 96 timer. Derefter blev 200 CCID50/100 µL virusopløsning fortyndet til 10-1~10-3. Cellekulturmediet i 96-brøndspladen blev kasseret, 150 µL af virusvedligeholdelsesopløsningen blev tilsat til hver brønd, og virusopløsningsfortyndingen blev inokuleret i en koncentration på 10-1~{{33} } i brøndene på 96-brøndspladen (50 µL pr. brønd). Hver fortynding blev gentaget i 8 brønde; en normal cellekontrol blev sat på samme tid, efterfulgt af dyrkning i 96 timer. Ændringerne i celle-CPE blev observeret under et omvendt mikroskop. Den normale cellekontrol bør ikke have nogen cytopatiske ændringer, og den positive kontrol bør have CPE-ændringer. Neutraliseringsendepunkter (serumfortyndinger konverteret til logaritmer) blev beregnet ved at observere CPE. Det seronegative/positive kriterium var 1:12 som det positive/negative kriterium,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Live neutraliseringsanalyse

Museserumneutraliseringsaktiviteten blev evalueret ved en levende neutralisationstest. Det fortyndede serum blev blandet med SARS-CoV-2 og inkuberet ved 37 ◦C i 1 time. Blandingen blev tilsat til en 96-brøndplade for at inficere Vero E6-cellerne. Efter 72- timers inkubation ved 37 ◦C blev den viruscytopatiske effekt (CPE) observeret under x40 forstørrelse, og neutralisationstiteren (den reciproke af 50 % serumfortynding påkrævet for at neutralisere virusinfektion) blev beregnet. Ovenstående procedurer blev alle udført i et biosikkerhedsniveau 3 miljø.

2.11. Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved en t-test med to prøver ved brug af SPSS 26. p-værdier Mindre end eller lig med 0.05 blev betragtet som signifikante. Den centrale tendens blev målt med den geometriske middeltiter (GMT).

3. Resultater

3.1. Rekombinant adenoviruskonstruktion

Det rekombinante adenovirus-shuttle-plasmid pAdeno-CMV-S1 med korrekt insertion blev opnået; dets strukturdiagram er vist i figur 1. Det rekombinante adenovirus indeholdt HAdV-C5-genomet, der manglede E1/E3-regionen. Et skematisk diagram af den rekombinante adenovirusvektor opnået ved shuttleplasmid- og cytoskeletplasmidtransfektion i HEK293-celler er vist i figur 1.

3.2. Karakterisering af rekombinant adenovirus

Det rekombinante plasmid indeholdende målgenet blev identificeret ved PCR (se figur 2A for gelelektroforeseresultater). Dette var et gentaget eksperiment. Primersekvenserne var MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag og S1-R acaataagtagggactgggtc, og sekventering bekræftede, at sekvensen var i overensstemmelse med designet. SARS-CoV-2 S1-ekspression i cellerne blev påvist med Western blotting (figur 2B) og indirekte immunfluorescens (figur 2C). Båndfarven (~75 kDa) blev påvist ved Western blotting og var i overensstemmelse med den forventede båndposition. På det transkriptionelle niveau blev in vitro-ekspressionen af ​​S1 påvist ved PT-PCR. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​S1-mRNA i HEK-293-celler var signifikant højere end i kontrolgruppen.

Figur 1. Konstruktion af rekombinant adenovirusvaccine og eksperimentel strategi. (A) pAdeno-CMV-S1 er et rekombinant adenovirus-shuttleplasmid, der indeholder målgenet S1. pBHGlox∆E1,3Cre er adenovirusskeletplasmidet. pBHGlox∆E1,3Cre og pAdeno-CMV-S1 blev ekstraheret med et QIAGEN plasmidekstraktionssæt (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Beijing, Kina). En dag før transfektion blev HEK293-celler passeret i en 25 cm2 cellekulturkolbe. Dyrkningsmediet var DMEM indeholdende 5% FBS uden antibiotika. På den anden dag blev 60-80% af cellerne udvalgt, og transfektionsopløsningen blev tilsat til cellerne. Efter 7 dages transfektion blev cellerne skrabet af, centrifugeret, supernatanten kasseret, og cellerne blev genoplivet med PBS. Cellerne blev fryse-tøet gentagne gange ved -80 ◦C og 37 ◦C. Efter centrifugering indeholdt supernatanten den primære virusopløsning. Den rekombinante adenovirusstamme blev oprenset, amplificeret og opnået efter yderligere behandling og betegnet Ad-S1. Vaccinen blev injiceret intramuskulært i musene til opfølgende undersøgelser. (B) Den afbildede tidsskala for immunisering og blodabstinenser.

3.3. Adenovirus titer

I dette eksperiment blev et gennemsnit på seks positive celler beregnet i fem mikroskopiske felter, og virussen i brønden blev fortyndet 108 gange. Baseret på formlen beskrevet i afsnittet Materialer og metode var adenovirustiteren 4,74 × 1011 plakdannende enheder (pfu)/ml (figur 2D).

3.4. Cellulær immunitet efter vaccination

I løbet af testperioden var der statistisk signifikante ændringer i serumcytokiner (p Mindre end eller lig med 0.05), hvilket hovedsageligt viste, at koncentrationen af ​​Keratinocyte kemoattraktant/humant vækstreguleret onkogen (KC/GRO) var faldet, og koncentrationerne af IFN-, IL-10, IL-12p70, IL-1, IL-2, IL-4, IL{{10} } og TNF- blev øget, mens koncentrationen af ​​IL-6 ikke var signifikant ændret (figur 3).

Figur 2. Identifikation af rekombinant HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1-protein og bestemmelse af adenovirustiter. (A) PCR-påvisning af det rekombinante plasmid med målgenet S1. (B) Western blot-detektion af SARS-CoV-2. Eksponentiel vækst HEK293-celler blev inficeret med SARS-CoV-2 i 48 timer, derefter blev det cellulære protein ekstraheret og separeret med SDS-PAGE. SARS-CoV-2-ekspression blev bekræftet ved Western blotting med gede-anti-kanin-IgG. (C) Immunfluorescensmikroskopi af HEK-293-celler inficeret med Ad-S1 (grøn). Celler blev modfarvet med 40, 6-diamidino- 2-phenylindol (DAPI) for at farve kernerne. Skala bar 1000 µm. (D) Plaqueassay blev brugt til måling. Mikrografier, der viser 10-5, 10-6, 10-7 og 10-8 fortynding (fra venstre mod højre).

Figur 3. Ad-S1 inducerede ændrede plasmaniveauer af type 1/2 cytokiner, type 1 interferoner og andre cytokiner. Resultaterne blev påvist ved at tage blod fra musene 7 dage efter den første immunisering. Dataene præsenteres som boks- og whisker-spredningsplot. Hver cirkel repræsenterer et enkelt individ. p-værdier blev beregnet ved hjælp af en to-prøve t-test.

3.5. Påvisning af anti-SARS-CoV-2 S1-antistoffer efter immunisering

ELISA afslørede, at SARS-CoV-2-specifikke antistoffer var til stede i musene, der blev injiceret med den første og anden Ad-S1, men ikke dem, der var injiceret med kontroladenovirus-capsidet eller PBS-opløsningen (Ad/PBS) (figur 4A). IgG-titere på 1:210 og 1:212 blev påvist i de Ad-S{10}}vaccinerede mus to uger efter henholdsvis første og anden immunisering. Fortyndingstiteren 28 dage efter vaccination (D28, GMT 2297,4) var 6,1-fold højere end ved D14 (GMT 378,9).

Figur 4. Ad-S1 inducerede høje titere af antistoffer (A) og neutraliseringsaktivitet (B, C) i mus. (A) ELISA af SARS-CoV-2-specifikt serum IgG fra Ad-S1-immuniserede mus. (B) Analyse af pseudovirusaktiviteter af serum fra de Ad-S1-immuniserede mus. (C) Analyse af neutraliserende aktiviteter af serum fra de Ad-S1-immuniserede mus

3.6. Neutraliserende antistofanalyse

SARS-CoV-2-udfordring af Vero E6-celler muliggjorde påvisning af neutraliserende aktivitet i det immuniserede museserum (figur 4B, C). D14- og D28-neutraliseringstiterne for de Ad-S1-immuniserede Vero E6-celler mod SARS-CoV{{10}}-levende virusudfordring in vitro var henholdsvis 1:24,3 og 1:26,3. Pseudovirusassayet gav resultater svarende til resultaterne for levende virusassayet med neutralisationstitre på op til 1:28,1 og 1:29,6 ved henholdsvis D14 og D28. Den D28 pseudovirus neutraliserende titer (GMT 769.0) var 2.7- gange højere end den for D14 (GMT 283.7).

4. Diskussion

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 til<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

I denne undersøgelse konstruerede vi en rekombinant adenovirus SARS-CoV-2-vaccine indeholdende SARS-CoV-2 S1-underenheden og betegnede den Ad-S1. Ligesom CanSinoBIO, som er godkendt til markedsføring [28], brugte vi HAdV-C5 i denne vaccine. Adenovirus anvendes i vid udstrækning i rekombinant genterapi og som en vaccinevektor. Imidlertid er den seropositive rate af HAdV-C5 så høj som 75-80% i den normale befolkning [29]. Dette indebærer, at præ-opbevaringsimmunitet mod HAdV-C5 vektorer signifikant reducerer vaccine-induceret immunitet. ChAdOx1 nCoV-19, der er udviklet ved University of Oxford i Det Forenede Kongerige, bruger en chimpanse-adenovirusvektor, der derimod har en lavere seropositiv rate hos mennesker, og når den er positiv, viser den normalt en lavere serumantistoftiter [30] . Derfor kan adenovirusvektorer, der kan unddrage sig allerede eksisterende immunitet, udforskes for at øge den beskyttende effektivitet af adenovirusvaccinen. I den foreliggende undersøgelse blev serumstatus for mus før og efter immunisering bestemt ved ELISA og neutraliseringstest og gav bevis for humoral immunitet for vaccinekandidater. Serumet produceret efter intramuskulær injektion af vaccinen i mus beskyttede effektivt Vero E6-celler mod SARS-CoV-2-infektion in vitro (figur 4). Vi opdagede også et stærkere immunrespons og bedre beskyttelse i musene efter en anden immunisering (figur 4). Vores eksperimentelle resultater ligner almindelige eksperimentelle resultater.

Efterhånden som SARS-CoV-2-forskningen fortsætter, har adskillige undersøgelser vist, at cytokinstormen sekundært til SARS-CoV-2-infektion kan påvirke T-celleproduktionen, hvilket gør det vanskeligt for patienter at opretholde langsigtet immunitet over for SARS-CoV-2 [31]. Derfor er det nødvendigt at bestemme, om Ad-S1 kan inducere T-celle-medieret immunitet hos mus. Vores resultater viste, at IFN- og IL-12-koncentrationer steg, og IL-4-koncentrationer faldt i Ad-S1-gruppen, hvilket indikerer, at den vaccine-inducerede Th1-celleoverlevelse og vækst i musene. IL-12, IL-10 og TNF-sekretion fra Th1-cellerne steg en smule i forsøgsgruppen. Disse resultater indikerede, at Ad-S1 effektivt inducerede en Th1--forspændt T-celle-respons i musene [32]. Den øgede IL-5 indikerede, at Th2-celler også deltager i immunresponset og producerer visse effekter. KC/GRO-koncentrationen i forsøgsgruppen var signifikant reduceret sammenlignet med PBS-kontrolgruppen, hvilket kan have været på grund af den reducerede neutrofile kemotaksi, der undertrykte den inflammatoriske reaktion og gjorde det muligt at kontrollere vaccinens bivirkninger en smule. Dette ville være mere gavnligt for immunkompromitterede mennesker, såsom ældre eller patienter, der gennemgår kemoterapi. Li M., et al. [29] udviklede en adenovirusvaccine under anvendelse af Ad68 som vektor. Resultaterne viste, at in vivo neutraliserende aktivitet af SARS-CoV-2 kunne påvises inden for to uger efter intramuskulær immunisering af BALB/c-mus og derefter fortsatte med at stige, og neutraliseringsantistoftiteren (PRNT ID50) nåede 957,3 kl. uger. I mellemtiden, i undersøgelsen af ​​Liu J., et al. [33] blev der udviklet vacciner, der anvender AdC6 og AdC68 som vektorer; både bindende og neutraliserende antistofresponser efter immunisering blev genereret 14 dage efter dosis med en IgG-titer på 7108 (geometrisk middeltiter, GMT; AdC6) og 5489 (GMT, AdC68). Neutralisationstiteren 50 (NT50) af pseudovirusneutraliseringsassayet var 125 (GMT, AdC6) og 67 (GMT, AdC68).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

I denne undersøgelse havde mus vaccineret med Ad-S1 IgG-titere på 1:1010 og 1:122 påvist ved ELISA to uger efter henholdsvis den første og anden immunisering. Fortyndingstiteren for ad-s1 var 378,9 (GMT) 14 dage efter inokulering og 2297,4 (GMT) 28 dage efter inokulering. I neutraliseringsantistoftesten udviste Vero E6-celler immuniseret med Ad-S1 1:24,3 og 1:26,3 neutralisering ved D14 og D28 mod levende SARS-CoV-2 virusudfordring in vitro. Neutraliseringstiterne for pseudoviruset ved D14 og D28 var henholdsvis 283,7 (GMT) og 769,0 (GMT). Således var vaccinen i denne undersøgelse mere effektiv med hensyn til immunresponset i musemodellen.

På grund af begrænsningen af ​​de eksperimentelle betingelser udførte vi ikke enzym-linked immunosorbent spot (ELISpot) analyse af miltens immunceller fra forsøgsmusene. Desuden kunne angrebsbeskyttelseseksperimenter med SARS-CoV-2 på mus ikke udføres på grund af begrænsningerne i det fysiske beskyttelseslaboratorium. Vi fastslog imidlertid, at vaccinen havde høj effektivitet i musemodeller og kunne bruges som en ideel reservevaccinestamme. Derudover bør immunogeniciteten, sikkerheden og effektiviteten af ​​potentielle SARS-CoV-2-vaccinekandidater undersøges i yderligere dyremodeller (f.eks. kaniner, primater, vaskebjørne, hunde), da musemodeller muligvis ikke fuldstændigt duplikerer human immunologisk funktioner.

cistanche planteforøgende immunsystem

5. Konklusioner

Data opnået fra vores prækliniske undersøgelser af adenovirusvaccinen viste, at vaccinen har tilstrækkelig sikkerhed og effektivitet. Derfor kan det være en lovende og gennemførlig profylaktisk vaccine mod SARS-CoV-2-infektion.

Referencer

1. Trougakos, IP; Stamatelopoulos, K.; Terpos, E.; Tsitsilonis, OE; Aivalioti, E.; Paraskevis, D.; Kastritis, E.; Pavlakis, GN; Dimopoulos, MA Indsigt i SARS-CoV-2 livscyklus, patofysiologi og rationaliserede behandlinger, der er rettet mod COVID-19 kliniske komplikationer. J. Biomed. Sci. 2021, 28, 9. [CrossRef]

2. Pillay, Månedens TS-gen: Det nye 2019-nCoV/SARS-CoV-2 nye coronavirus-spidsprotein. J. Clin. Pathol. 2020, 73, 366-369. [CrossRef]

3. Sheinin, M.; Jeong, B.; Paidi, RK; Pahan, K. Regression af lungekræft hos mus ved intranasal administration af SARS-CoV-2 Spike S1. Cancers 2022, 14, 5648. [CrossRef]

4. Kadam, SB; Sukhramani, GS; Bishnoi, P.; Pable, AA; Barvkar, VT SARS-CoV-2, den pandemiske coronavirus: Molekylær og strukturel indsigt. J. Basic Microbiol. 2021, 61, 180-202. [CrossRef]

5. Sternberg, A.; Naujokat, C. Strukturelle træk ved coronavirus SARS-CoV-2-spidsprotein: Mål for vaccination. Life Sci. 2020, 257, 118056. [CrossRef] [PubMed]

6. Vægge, AC; Tortorici, MA; Frenz, B.; Snijder, J.; Li, W.; Rey, FA; DiMaio, F.; Bosch, BJ; Veesler, D. Glycan-skjold og epitopmaskering af et coronavirus-spidsprotein observeret ved kryo-elektronmikroskopi. Nat. Struktur. Mol. Biol. 2016, 23, 899-905. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, Y.; Wang, L.; Cao, H.; Liu, C. SARS-CoV-2 S1 er RBD overlegen som et COVID-19-underenhedsvaccineantigen. J. Med. Virol. 2021, 93, 892-898. [CrossRef]

8. Theoharides, TC; Conti, P. Vær opmærksom på SARS-CoV-2 spidsprotein: Der er mere end man kan se. J. Biol. Regul. Homeost. Agenter 2021, 35, 833-838. [CrossRef] [PubMed]

9. Guo, X.; Deng, Y.; Chen, H.; Lan, J.; Wang, W.; Zou, X.; Hung, T.; Lu, Z.; Tan, W. Systemisk og slimhindeimmunitet hos mus fremkaldt af en enkelt immunisering med human adenovirus type 5 eller 41 vektor-baserede vacciner, der bærer spikeproteinet fra Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology 2015, 145, 476-484. [CrossRef] [PubMed]

10. Gao, J.; Mese, K.; Bunz, O.; Ehrhardt, A. State-of-the-art human adenovirus vektorologi til terapeutiske tilgange. FEBS Lett. 2019, 593, 3609-3622. [CrossRef]

11. Xing, K.; Tu, XY; Liu, M.; Liang, ZW; Chen, JN; Li, JJ; Jiang, LG; Xing, FQ; Jiang, Y. Effekt og sikkerhed af COVID-19-vacciner: En systematisk gennemgang. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi 2021, 23, 221-228. [CrossRef]

12. Voysey, M.; Clemens, SAC; Madhi, SA; Weckx, LY; Folegatti, premierminister; Aley, PK; Angus, B.; Baillie, VL; Barnabas, SL; Bhorat, QE; et al. Sikkerhed og effekt af ChAdOx1 nCoV-19-vaccinen (AZD1222) mod SARS-CoV-2: En foreløbig analyse af fire randomiserede kontrollerede forsøg i Brasilien, Sydafrika og Storbritannien. Lancet 2021, 397, 99-111. [CrossRef] [PubMed]

13. Li, C.; Guo, Y.; Fang, Z.; Zhang, H.; Zhang, Y.; Chen, K. Analyse af den beskyttende virkning af godkendte COVID-19-vacciner mod forskellige mutanter. Foran. Immunol. 2022, 13, 804945. [CrossRef] [PubMed]

14. Tanriover, MD; Do ˘ganay, HL; Akova, M.; Güner, HR; Azap, A.; Akhan, S.; Köse, ¸S.; Erdinç, F.; Akalin, EH; Tabak, Ö.F.; et al. Effekt og sikkerhed af en inaktiveret helvirion SARS-CoV-2-vaccine (CoronaVac): Foreløbige resultater af et dobbeltblindt, randomiseret, placebokontrolleret fase 3-forsøg i Tyrkiet. Lancet 2021, 398, 213-222. [CrossRef]

15. Xia, S.; Zhang, Y.; Wang, Y.; Wang, H.; Yang, Y.; Gao, GF; Tan, W.; Wu, G.; Xu, M.; Lou, Z. Sikkerhed og immunogenicitet af en inaktiveret SARS-CoV-2-vaccine, BBIBP-CorV: Et randomiseret, dobbeltblindt, placebokontrolleret fase 1/2-forsøg. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 39-51. [CrossRef] [PubMed]

16. Yang, S.; Li, Y.; Dai, L.; Wang, J.; Han, P.; Li, C.; Fang, X.; Wang, C.; Zhao, X.; Huang, E.; et al. Sikkerhed og immunogenicitet af en rekombinant tandem-repeat dimer RBD-baseret proteinunderenhedsvaccine (ZF2001) mod COVID-19 hos voksne: To randomiserede, dobbeltblindede, placebokontrollerede fase 1 og 2 forsøg. Lancet Infect. Dis. 2021, 21, 1107-1119. [CrossRef]

17. Mallapaty, S. Indiens DNA COVID-vaccine er en verdensførste - flere kommer. Natur 2021, 597, 161-162. [CrossRef]

18. Grifoni, A.; Weiskopf, D.; Ramirez, SI; Mateus, J.; Dan, JM; Moderbacher, CR; Rawlings, SA; Sutherland, A.; Premkumar, L.; Jadi, RS; et al. Mål for T-celleresponser på SARS-CoV-2 Coronavirus hos mennesker med COVID-19-sygdom og ueksponerede individer. Celle 2020, 181, 1489-1501.e1415. [CrossRef]

19. Cao, Y.; Su, B.; Guo, X.; Sun, W.; Deng, Y.; Bao, L.; Zhu, Q.; Zhang, X.; Zheng, Y.; Geng, C.; et al. Potent neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 identificeret ved high-throughput enkeltcellesekvensering af rekonvalescente patienters B-celler. Celle 2020, 182, 73–84.e16. [CrossRef]

20. Amanat, F.; Krammer, F. SARS-CoV-2 Vacciner: Statusrapport. Immunitet 2020, 52, 583-589. [CrossRef]

21. Li, Y.; Bi, Y.; Xiao, H.; Yao, Y.; Liu, X.; Hu, Z.; Duan, J.; Yang, Y.; Li, Z.; Li, Y.; et al. En ny DNA- og proteinkombination COVID-19-vaccineformulering giver fuld beskyttelse mod SARS-CoV-2 i rhesus-makaker. Emerg. Mikrober inficerer. 2021, 10, 342-355. [CrossRef]

22. Du, L.; Hej.; Zhou, Y.; Liu, S.; Zheng, BJ; Jiang, S. Spikeproteinet i SARS-CoV – et mål for vaccine og terapeutisk udvikling. Nat. Rev. Microbiol. 2009, 7, 226-236. [CrossRef] [PubMed]

23. Yue, L.; Cao, H.; Xie, T.; Long, R.; Li, H.; Yang, T.; Yan, M.; Xie, Z. N-terminalt trunkeret nukleocapsidprotein af SARS-CoV-2 som en bedre serologisk markør end helt nukleocapsidprotein ved evaluering af immunogeniciteten af ​​inaktiveret SARS-CoV-2. J. Med. Virol. 2021, 93, 1732-1738. [CrossRef] [PubMed]

24. Greaney, AJ; Loes, AN; Gentle, LE; Crawford, KHD; Starr, TN; Malone, KD; Chu, HY; Bloom, JD SARS-CoV-2 mRNA-1273-vaccinen fremkalder mere RBD-fokuseret neutralisering, men med bredere antistofbinding i RBD. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Mantus, G.; Nyhoff, LE; Kauffman, RC; Edara, VV; Lai, L.; Floyd, K.; Shi, PY; Menachery, VD; Edupuganti, S.; Scherer, EM; et al. Evaluering af cellulære og serologiske reaktioner på akut SARS-CoV-2-infektion demonstrerer den funktionelle betydning af det receptorbindende domæne. J. Immunol. 2021, 206, 2605-2613. [CrossRef]

26. Han, Y.; Zhou, Y.; Liu, S.; Kou, Z.; Li, W.; Farzan, M.; Jiang, S. Receptorbindende domæne af SARS-CoV spike protein inducerer stærkt potente neutraliserende antistoffer: Implikation for udvikling af underenhedsvaccine. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2004, 324, 773-781. [CrossRef]

27. Deng, S.; Liang, H.; Chen, P.; Li, Y.; Li, Z.; Fan, S.; Wu, K.; Li, X.; Chen, W.; Qin, Y.; et al. Udvikling og anvendelse af viral vektorvaccine under COVID-19-pandemien. Microorganisms 2022, 10, 1450. [CrossRef]

28. Zhu, FC; Guan, XH; Li, YH; Huang, JY; Jiang, T.; Hou, LH; Li, JX; Yang, BF; Wang, L.; Wang, WJ; et al. Immunogenicitet og sikkerhed af en rekombinant adenovirus type-5-vektoreret COVID-19-vaccine hos raske voksne i alderen 18 år eller ældre: Et randomiseret, dobbeltblindt, placebokontrolleret fase 2-forsøg. Lancet 2020, 396, 479-488. [CrossRef]

29. Li, M.; Guo, J.; Lu, S.; Zhou, R.; Shi, H.; Shi, X.; Cheng, L.; Liang, Q.; Liu, H.; Wang, P.; et al. Enkeltdosisvaccination med en chimpanse-adenovirus-baseret vaccine inducerer vedvarende og beskyttende immunitet mod SARS-CoV-2-infektion. Foran. Immunol. 2021, 12, 697074. [CrossRef]

30. Guo, J.; Mondal, M.; Zhou, D. Udvikling af nye vaccinevektorer: Chimpanse adenovirale vektorer. Hum. Vacciner Immunother. 2018, 14, 1679-1685. [CrossRef]

31. Kaneko, N.; Kuo, HH; Boucau, J.; Farmer, JR; Allard-Chamard, H.; Mahajan, VS; Piechocka-Trocha, A.; Lefteri, K.; Osborn, M.; Bals, J.; et al. Tab af Bcl-6-Udtrykkende T-follikulære hjælpeceller og germinale centre i COVID-19. Celle 2020, 183, 143-157.e113. [CrossRef] [PubMed]

32. Lexberg, MH; Taubner, A.; Albrecht, I.; Lepenies, I.; Richter, A.; Kamradt, T.; Radbruch, A.; Chang, HD IFN- og IL-12 synergerer for at konvertere in vivo genereret Th17 til Th1/Th17-celler. Eur. J. Immunol. 2010, 40, 3017-3027. [CrossRef] [PubMed]

33. Liu, J.; Xu, K.; Xing, M.; Zhuo, Y.; Guo, J.; Du, M.; Wang, Q.; Nogen.; Li, J.; Gao, P.; et al. Heterologe prime-boost immuniseringer med chimpanse adenovirale vektorer fremkalder potent og beskyttende immunitet mod SARS-CoV-2-infektion. Cell Discov. 2021, 7, 123. [CrossRef] [PubMed]