Acylerede phenylethanoid oligoglycosider med hepatobeskyttende aktivitet fra ørkenplanten Cistanche Tubulosa

for flere oplysninger:Ali.ma@wecistanche.com

Toshio Morikawa et al

Abstrakt

Den metanoliske ekstrakt fra friske stilke afCistanche tubulosa(Orobanchaceae) viste sig at vise hepatobeskyttende virkninger mod D-galactosamin (D-GalN)/lipopolysaccharid (LPS)-induceret leverskade hos mus. Fra uddraget tre nyephenylethanoidoligoglycosider, kankanosider H1 (1), H2 (2) og I(3), blev isoleret sammen med 16phenylethanoid glycosider(4-19) og to acylerede oligosukkere (20,21). Strukturerne af 1-3 blev bestemt på basis af spektroskopiske egenskaber samt kemiske beviser. Blandt isolaterne er echinacosid (4, IC50=10,2 lM), acteosid (5, 4,6 lM), isoacteosid (6,5,3 lM), 20-acetylacteosid (8, 4,8 lM) og tubulosid A (10, 8,6 lM) inhiberede D-GalN-induceret død af hepatocytter. Disse fem isolater, 4 (31,1 lM), 5 (17,8 lM), 6 (22,7 lM), 8 (25,7 lM) og 10 (23,2 lM), og cistantubulosid B1 (11, 21,4 lM) reducerede også TNF-a- induceret cytotoksicitet i L929-celler. Desuden udviste hovedbestanddelene (4-6) in vivo hepatobeskyttende virkninger ved doser på 25-100 mg/kg, PO.

Klik for at cistanche bivirkninger og Cistanche-produkter

1. Introduktion

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) er en flerårig parasitisk plante, der vokser på rødder af Salvadora- eller Calotropis-arter og er udbredt i Nordafrika, Arabien og asiatiske lande.2Stængler afCistanche tubulosasamt assistancesalsa og Cistanche deserticola er traditionelt blevet brugt til behandling af impotens, sterilitet, lumbago og kropssvaghed samt et fremmende middel for blodcirkulationen.2,3 Tidligere har flerephenylethanoids, iridoider, monoterpener og lignaner blev isoleret fra Kina og PakistanCistanche tubulosa.2,4–9 I løbet af vores karakteriseringsundersøgelser af bioaktive bestanddele i denne naturmedicin har vi tidligere rapporteret, at fem iridoider, kankanosider A–D og kankanol, et monoterpeneglycosid, kankanosid E, tophenylethanoidoligoglycosider, kankanosider F og G (23) og et acyleret oligosukker, kankanose(21), blev isoleret fra methanolekstrakten af ​​tørrede stængler afCistanche tubulosa.10,11 Desuden blev methanolekstraktet og adskillige isolater, såsom echinacosid (4), acteosid (5), cistanosid F (20), 21 og kankanosid F, fundet at vise vasorelakserende virkninger, dvs. hæmmende virkninger mod inducerede sammentrækninger af noradrenalin i isoleret thorax aorta hos rotter.11 I vores fortsatte undersøgelser af bestanddele i planten er et methanolekstrakt af friske stængler afCistanche tubuli varfundet at vise en beskyttende effekt på leverskade induceret af D-galactosamin (D-GalN)/lipopolysaccharid (LPS) hos mus. Fra methanolekstraktet har vi isoleret tre nyephenylethanoidoligoglycosider kaldet kankanosider H1 (1), H2 (2) og I (3) sammen med 16 phenylethanoid glycosider (4-19) og to acylerede oligosukkere (20, 21). Dette papir beskæftiger sig med isolering og strukturel belysning af disse nyephenylethanoidoligoglykosider (1-3). Strukturelle krav til phenylethanoidglykosiderne til den hepatobeskyttende aktivitet diskuteres også (fig. 1)

2. Resultater og diskussion

2.1. Beskyttende effekt af methanolisk ekstrakt fra stængler afCistanche tubulosapå leverskade induceret af D-GalN/LPS hos mus

Friske stængler afCistanche tubulosa(dyrket i Urumqi, Xinjiang-provinsen, Kina) blev ekstraheret med methanol under tilbagesvaling, hvilket gav et methanolisk ekstrakt (8,36 procent fra de friske stilke). Som vist i tabel 1, ved doser på 250-500 mg/kg, PO, viste methanolekstrakten en hæmmende effekt på stigningen i serum aspartat aminotransaminase (sAST) og alanin aminotransaminase (sALT), markører for leverskade, induceret af D- GalN/LPS i mus.

2.2. Kemiske bestanddele fra stængler afCistanche tubulosa

Et methanolisk ekstrakt fra de friske stilke afCistanche tubulosablev underkastet Diaion HP-20-søjlekromatografi (H2O?MeOH) for at give H2O- og MeOH-eluerede fraktioner (henholdsvis 5,63 procent og 2,73 procent). Den MeOH-eluerede fraktion blev underkastet SiO2- og ODS-kolonnekromatografi og til sidst HPLC for at give tre nyephenylethanoidoligoglycosider, kankanosider H1 (1, 0.0008 procent), H2(2, 0,0001 procent) og I (3, 0,0007 procent) sammen med 16phenylethanoid glycosider, echinacoside2,11 (4, 0.45 procent ), acteosid2,11 (5, 0.28 procent ), isoacteosid2,11 (6, 0.0 41 procent ), cis-acteosid12,13 (7, 0.0007 procent ), 20-acetylacteosid2,11 (8, {{ 42}}.0{{50}}38 procent ), decaffeoylacteosid14 (9, 0.0002 procent ), tubulo side A2,11 (10, 0,013 procent), cistantubulosider B19 (11, 0,0020 procent), B29 (12,0,0003 procent), arenarioside15 (13, 0,0006 procent), wiedemanninosid C16 (14,0,0008 procent), cistantubulosid A9 (15, 0,0009 procent), syringalid A 30-OaL rhamnopyranoside4 (16, 0,0017 procent), campneosiderne I17,18 (17,18, 157, 1,0 procent) (157, 1,0 procent) , 0,0005 procent), og salidroside11 (19, 0,0027 procent), og to acylerede oligosukkere, cistanosid F11 (20, 0,0004 procent) og kankanose11 (21, 0,0004 procent).

2.3. Strukturer af kankanosider H1 (1), H2 (2) og I (3)

Kankanosid H1 (1) blev opnået som et hvidt pulver med negativ optisk rotation (½a-24D-45.3 i MeOH). Dets IR-spektrum viste absorptionsbånd ved 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1{{107}}70 og 1040 cm 1, der kan tilskrives hydroxyler, estercarbonyler, etherfunktioner, og aromatiske ringe. Det positive og negative ion FABMS-spektra af 1 viste kvasimomolekylære iontoppe ved henholdsvis m/z 835(M plus Na) plus og m/z 811 (MH), og molekylformlen blev bestemt som C37H48O20 ved højopløsningspositiv- ion FABMS måling. 1H- og 13C-NMR-spektrene for 1 (CD3OD, tabel 2 og 3), som blev tildelt ved forskellige NMR-eksperimenter,19 viste signaler, der kunne tildeles to methylener [d 2,70(2H, m, H2-7), 3,66 , 4,07 (1H hver, begge m, H2-8)], ortho- og meta-koblede aromatiske protoner af ABC-typen [d 6,52 (1H, dd, J=1.8,7.8 Hz, H{ {50}}), 6,65 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J=7,8 Hz,H{{62 }})], to bD-glucopyranosyldele [d 4,29 (1H, d, J=7,8 Hz, terminal-Glc-H-1), 4,54 (1H, d, J {{76 }}.2 Hz, indre-Glc-H-1)], og aa-L-rhamnopyranosyldel [d 1,06 (3H, d, J=6.0 Hz, Rha-H{{89 }}),4,80 (1H, br s, Rha-H-1)] sammen med en acetylgruppe [d 1,98(3H, s)] og en trans-p-coumaroylgruppe {en trans-olefin [d 6,34; , både d,J=8.7 Hz, H-3,5 og 2,6)]}. Forbindelser mellem oligoglycosid- og acyldelene i 1 blev karakteriseret ved et HMBC-eksperiment, som viste langrækkende korrelationer mellem følgende proton- og carbonpar: indre-Glc-H-1 og C-8 (dC71.9 ); indre-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, dd-lignende)] og acetylcarbonylcarbonet (dC 171,4); indre-Glc-H-4 [d 5,08 (1H, dd, J=9.6, 9,6 Hz)] og p-coumaroylcarbonylcarbonet (dC 168,2); Rha-H-1 og indre-Glc-C-3 (dC 80,5); og terminal-Glc-H-1 og indre-Glc-C-6 (dC69.3) (fig. 2). Til sidst frigjorde alkalisk hydrolyse af 1 med 5 procent kaliumhydroxid (KOH) trans-p-cumarsyre, som blev identificeret ved HPLC-analyse, sammen med et deacyleret produkt. Det deacylerede produkt blev successivt behandlet med 1,0 M saltsyre (HCl) for at frigive L-rhamnose og D-glucose, som blev identificeret ved HPLC-analyse ved brug af en optisk rotationsdetektor.10,11 Således blev strukturen af ​​kankanosid H1 belyst til at være {{181 }}(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl-(1- 3)-[bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl{{196 }}O-trans-p-coumaroyl-bD-glucopyranosid (1).

Kankanosid H2 (2) blev isoleret som et hvidt pulver med negativ optisk rotation (½a 25 D 52,4 i MeOH). Dens molekylære formel C37H48O20 viste sig at være den samme som for 1 ved højopløsnings-positiv-ion FABMS-måling. De spektroskopiske egenskaber af 2 var meget lig dem for 1, bortset fra signaler på grund af cis-p-coumaroylgruppen [d 5,79, 6,95 (1H hver, begge d, J=12,8 Hz, H{{ 22}} og 7), 6,76, 7,73 (2H hver, begge d, J=8,7 Hz, H-3,5 og 2,6)]. Ydermere afslørede HMBC-eksperiment på 2 også lignende tilstande for langdistancekorrelationer som dem, der blev påvist for 1 mellem følgende proton- og carbonpar: indre-Glc-H-1 [d 4,51 (1H, d, J {{44) }},8 Hz)] og C-8 (dC 72,0); indre-Glc-H-2 [d 4,88 (1H, m)] og acetylcarbonylcarbonet (dC 171,4); indre-Glc-H-4 [d 4,98 (1H, dd, J=9,6, 9,7 Hz)] og p-coumaroylcarbonylcarbonet (dC 166,7); Rha-H-1 [d 4,77 (1H, d, J=1,4 Hz, Rha-H-1)] og indre-Glc-C-3 (dC 80,7 ); og terminal-Glc-H-1 [d 4,28 (1H, d, J=7,8 Hz)] og indre-Glc-C-6 (dC 69,4) (fig. 2) . Ved nedbrydningsundersøgelsen gav 2 cis-p-cumarsyre og to samme sukkerarter som dem, der blev opnået i tilfældet med 1. Som følge heraf blev strukturen af ​​kankanosid H2 belyst til at være 2-(3,4- dihydroxyphenyl)ethyl OaL-rhamnopyranosyl-(1-3)- [bD-glucopyranosyl-(1-6)]-2-O-acetyl-4-O-cis-p-coumaroyl- bD-glucopyranosid (2).

Kankanosid I (3) blev også isoleret som et hvidt pulver med negativ optisk rotation (½a- 25D-62.2 i MeOH). Dens molekylære formel, C35H46O18, blev bestemt ved positive- og negative-FABMS- og HRFABMS-målinger. De spektroskopiske egenskaber af 3(CD3OD, tabel 2 og 3) kunne overlejres på dem af echinacoside (4), bortset fra signaler på grund af aglycondelen {{to methylener {d 2,95 (2H, dd, J=7). 3, 7,8 Hz, H2-7), [3,79 (1H, m), 4,10 (1H,dt, J=16,9, 7,3 Hz), H{{32} }]}, monosubstituerede aromatiske protoner [d7,18 (1H, m, H-4), 7,26-7,28 (4H, m, H-2,6, 3,5)]}}. Alkalisk hydrolyse af 3 med 5 procent KOH frigivet trans-koffeinsyre, og det deacylerede produkt blev successivt behandlet med 1,0 M HCI for at frigive L-rhamnose og D-glucose. Endelig blev forbindelser af acylgruppen og sukkergrupperne i 3 afklaret ved HMBC-eksperimentet, som vist i figur 2. På basis af ovennævnte beviser blev strukturen af ​​kankanosid I belyst til at være 2-phenylethyl OaL- rhamnopyranosyl-(1-3)-[bD-glucopyrano-syl-(1-6)]-4-O-trans-caffeoyl-bD-glucopyranosid (3)

2.4. Virkninger af kemiske bestanddele fra stænglerne af Cistanche tubulosa på D-GalN-induceret cytotoksicitet i primære dyrkede musehepatocytter

D-GalN/LPS-induceret leverskade er kendt for at udvikle viaimmunologiske responser.19 Denne type leverskade er rapporteret at forekomme i to former. For det første øges følsomhed over for TNF-a ved udtømning af uridintriphosphat i hepatocytter af D-GalN. For det andet frigives pro-inflammatoriske mediatorer, såsom NO og TNF-a, fra LPS-aktiverede makrofager (Kupffers celler). Apoptose af hepatocytter af TNF-a er rapporteret at have en vigtig rolle i D-GalN/LPS-induceret leverskade.20

I vores tidligere undersøgelser af leverbeskyttende forbindelser fra naturlægemidler rapporterede vi, at adskillige bestanddele fra Hovenia Dulcis, 21 Bupleurum scorzonerifolium, 22,23 Curcuma zedoaria, 24–26Angelica furcijuga, 27,28 Betula sativum, 30 Salacia reticulastata, 30 Salacia 13 2 argenta, hierochuntica, 33 Panax notoginseng, 34 Cyperus longus, 35 Erycibe expansa, 36 Camellia sinensis, 37 Sedum sarmentosum, 38, 39 Sinocrassula indica, 40 Hedychium coronarium, 41 og Piper chaba42, 43 udviste leverbeskyttende effekt af LP-skadende/skadende N-G hos mus og/eller platyphylla var. japonica,29 Pisum-hæmmende virkning på D-GalN-induceret cytotoksicitet i primære dyrkede hepatocytter. Da det methanoliske ekstrakt fra stænglerne afCistanche tubulosaviste hepatobeskyttende virkninger på D-GalN/LPS-induceret leverskade hos mus (vide ante), den hæmmende effekt af bestanddelene på D-GalN-induceret cytotoksicitet i primære dyrkede musehepatocytter blev undersøgt ved hjælp af 3-(4,{ {6}}dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Som vist i tabel 4, echinacosid (4, IC50=10,2 lM), acteosid (5, 4,6 lM), isoaceteosid(6, 5,3 lM), 20-acetylacteosid (8, 4,8 lM), tubulosid A (10,8,6 lM) og B11 (22, 14,6 lM) og kankanosid G11 (23, 14,8 lM) viste stærk aktivitet. Deres aktiviteter var større end kommerciel silybin (38,8 lM),33-43 som en positiv kontrol.44,45 De strukturelle krav tilphenylethanoid glycosider for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM), 5 >> cistanoside F (20, >100 lM); (2) aglyconen med 3,4-dihydroxygruppen udviste stærkere aktivitet end den med 4-hydroxygruppen (6 > 23); (3) 60-ObD-glucopyranosyl-delen reducerede aktiviteten (4 < 5,10="">< 8);="" (4)="" 8-obd-glucopyranosyl-delen="" med="" 40-o-caffeoyl-gruppen="" viste="" stærkere="" aktivitet="" end="" den,="" der="" havde="" 60-o-caffeoyl-gruppen="" (5="6," 8=""> 22 ); og (5) introduktion af 20-O-acetyldelen reducerede aktiviteten (8 5 5, 22 <>

Next, effects of the principal constituents (4–6) on NO and TNF productions, as markers of macrophage activation in LPS-activated mouse peritoneal macrophages were examined.43,46,47 As a result, these constituents (4–6) showed neither NO nor TNF production inhibitory activities (IC50 >100 lM, data ikke vist). Disse forbindelser viste sig således ikke at påvirke overproduktionen af ​​NO og TNF-a fra LPS-aktiverede makrofager.

2.5. Virkninger af de kemiske bestanddele på TNF-a-induceret cytotoksicitet i L929-celler

For at klarlægge virkningerne af bestanddelene på hepatocytters følsomhed over for TNF-a, TNF-a-induceret fald i levedygtigheden af ​​L929-celler, blev en TNF-a-følsom cellelinje48 undersøgt ved hjælp af MTT-assayet. Uden testprøver blev cellelevedygtigheden reduceret til ca. 60 procent efter inkubation af cellerne med 20 ng/mL TNF-a i 44 timer sammenlignet med tilfældet uden TNF-a. Som vist i tabel 5, echinacosid (4, IC50=31,1 lM), acteosid (5, 17,8 lM), isoaceteosid (6, 22,7 lM), 20-acetylacteosid (8, 25,7 lM), tubulosid A (10,23,2 µM) og cistantubulosid B1 (11, 21,4 µM) hæmmede faldet i cellelevedygtigheden, og deres aktiviteter blev fundet større end dem for piperin42,43 og silybin. De strukturelle krav tilphenylethanoid glycosider for the activity were as follows; (1) the aglycone part was essential for the activity [4 >> kankanose (21, >100 lM)]; (2) the aglycone having the 3,4-dihydroxy group showed stronger activity than that having the 4-hydroxy group [4 > cistantubuloside A (15, >100 lM), 5 > syringalide A 30 -O-a-L-rhamnopyranoside (16, >100 lM), 6 > kankanoside G (23, >100 lM)]; (3) the 60 -O-b-D-glucopyranosyl moiety reduced the activity (4 < 5); (4) the 8-O-b-D-glucopyranosyl part having the 40 -O-caffeoyl group showed stronger activity than that having the 60 -O-caffeoyl group [5 > 6, 8 > tubuloside B (22, >100 lM)]; og (5) introduktion af 20-O-acetyldelen reducerede aktiviteten (8 < 5,="" 22="">< 6).="" disse="" krav="" blev="" fundet="" svarende="" til="" dem,="" der="" blev="" observeret="" i="" det="" foregående="" kapitel="" vedrørende="" de="" hæmmende="" virkninger="" på="" d-galn-induceret="" cytotoksicitet="" i="" primære="" dyrkede="">

Disse in vitro-fund tyder på følgende mulige virkningsmekanismer for den leverbeskyttende virkning af bestanddelene af stænglerCistanche tubulosa: (i) fald i D-GalN-induceret cytotoksicitet (4-6, 8, 10, 22 og 23) og (ii) fald i TNF-a-induceret cytotoksicitet (4-6, 8, 10 og 11) .

2.6. Beskyttende virkninger af echinacosid (4), acteosid (5), andisoacteosid (6) mod leverskade induceret af D-GalN/LPS-mus og deres virkemåde

Til sidst undersøgte vi effekten af ​​principalphenylethanoid glycosider, echinacosid (4), acteosid (5) og isoacteosid (6) på den D-GalN/LPS-inducerede leverskade hos mus. Som vist i tabel 6 og 4-6 hæmmede signifikant stigningen af ​​sAST og salt induceret af D-GalN/LPS i mus ved doser på 25-100 mg/kg, PO. På den anden side påvirkede 4-6 ikke overproduktionen af ​​TNF-a fra LPS-aktiverede makrofager. Endvidere hæmmede 4-6 signifikant døden af ​​L929-celler forårsaget af TNF-a, hvilket indikerer et fald i L929-cellers følsomhed over for TNF-a (vide ante). Disse resultater tyder på, at 4-6 reducerer disse cellers følsomhed over for den TNF-a-inducerede cytotoksicitet. Mange forbindelser, der inhiberer celledød induceret af D-GalN og produktion af TNF-a, er blevet rapporteret,24,26,32, men der rapporterede få forbindelser, der selektivt reducerer følsomheden af ​​hepatocytter over for TNF-a.42,43,49,50

Afslutningsvis fra friske stængler afCistanche tubulosa, tre nyephenylethanoid glycosider, kankanosider H1 (1), H2 (2) og I (3) sammen med 16 kendtephenylethanoid glycosider(4-19) og toacylerede oligosukkere (20, 21) blev isoleret. Strukturelle krav til deres beskyttende virkninger på hepatocytbeskadigelse induceret af D-GalN og cytobeskyttende virkninger på L929-celler forårsaget af TNF-a var som følger; (1) aglycondelen var essentiel for aktiviteten; (2) aglyconen med 3,4-dihydroxygruppen viste stærkere aktivitet end den, der havde 4-hydroxygruppen;(3) 60-ObD-glucopyranosyl-delen reducerede aktiviteten; (4) 8-ObD-glucopyranosyl-delen med 40-O-caffeoyl-gruppen viste stærkere aktivitet end den med 60-O-caffeoyl-gruppen; og (5) introduktion af {{27 }}O-acetyldel reducerede aktiviteten. Ydermere, principalphenylethanoid glycosider, echinacosid(4), acteosid (5) og isoacteosid (6), hæmmede stigningen insAST og salt ved doser på 25-100 mg/kg PO i D-GalN/LPS-behandlede mus, og disse hæmmende virkninger blev foreslået at være afhængig af hepatocytters reducerede følsomhed over for TNF-a. De detaljerede virkningsmekanismer afphenylethanoid glycosiderbør studeres nærmere.

3. Eksperimentel

3.1. Generel

Følgende instrumenter blev brugt til at opnå spektrale og fysiske data: specifikke rotationer, Horiba SEPA-300 digital polarimeter(l=5 cm); UV-spektre, Shimadzu UV-1600-spektrometer; IR-spektre,Shimadzu FTIR-8100-spektrometer; 1H og 13C NMR-spektre, JEOLJNM-ECA600 (600 og 150 MHz) og JEOL JNM-ECS400 (400 og 100 HMz) spektrometre med tetramethylsilan som intern standard; FABMS og højopløsnings FABMS, JEOL JMS-SX 102A massespektrometer; HPLC-detektor, Shimadzu RID-10Et brydningsindeks, Shimadzu SPD-10A UV-vis og Shodex ELLER-2 optiske rotationsdetektorer. HPLC-søjle, Cosmosil 5C18-MS-II og pNAP (Nacalai TesqueInc., 250 4,6 mm id) og (250 - 20 mm id) kolonner blev brugt til henholdsvis analytiske og præparative formål.

Følgende eksperimentelle betingelser blev brugt til kromatografi: normalfase silicagelsøjlekromatografi (CC),silicagel 60 N (Kanto Chemical Co., Ltd, 63-210 mesh, sfærisk, neutral ); omvendt fase silicagel CC, Diaion HP-20 (NipponRensui) og Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 100-200 mesh); normalfase TLC, præcoatede TLC-plader med silicagel 60F254 (Merck, 0,25 mm); omvendt fase TLC, præcoatede TLC-plader med silicagel RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); omvendt fase HPTLC, præcoatede TLC-plader med silicagel RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm), detektionen blev opnået ved at sprøjte med 1 procent Ce(SO4)2-10 procent vandig H2SO4, efterfulgt af opvarmning .

3.2. Plantemateriale

Friske stængler afCistanche tubulosadyrket i Urumqi, Xinjiang-provinsen, Kina blev indsamlet i september 2007. Plantematerialet blev identificeret af en af ​​forfatterne (MY). En voucher for plantematerialet ligger i vores laboratorium.

3.3. Udvinding og isolering

De friske stængler afCistanche tubulosa(2,98 kg) blev fint skåret og ekstraheret tre gange med methanol under tilbagesvaling i 3 timer. Afdampning af opløsningsmidlet under reduceret tryk gav en methanolisk ekstrakt (249,1 g, 8,36 procent). Den methanoliske ekstrakt blev underkastet Diaion HP 20 CC (5,0 kg, H2O?MeOH) for at give H2O- og MeOH-eluerede fraktioner (167,84 g, 5,63 procent og 81,21 g, 2,73 procent) , henholdsvis). Den MeOH-eluerede fraktion (61,00 g) blev udsat for normalfase silicagel CC[1,8 kg, CHCl3-MeOH-H2O (15:3:0.4?1{{48} }:3:0.5?6:4:1, v/v/v)?MeOH] for at give syv fraktioner [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4(10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) og 7 (4,60 g)]. Fraktionen 2 (9,56 g) blev adskilt med omvendt fase silicagel CC [400 g,MeOH–H2O (1{{201}}:90, v /v)?MeOH?acetone] for at give fem fraktioner [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) og 2-5 (31,9 mg)]. Fraktionen 2-3 (1,00 g) blev underkastet HPLC [Cosmo sil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (7:93, v/ v)] for at give syvbrøker [Fr. 2-3-1 (66,5 mg), 2-3-2 (20,4 mg), 2-3-3 (26,0 mg), 2-3-4 (136,6) mg), 2-3-5 (38{{300}},6 mg), 2-3-7 (84,9 mg)]. Fraktionen 2-3-4 (106,6 mg) blev yderligere oprenset ved HPLC [Cosmosil pNAP,CH3CN-1 procent vandig AcOH (5:95, v/v)] for at give salidrosid (19,13,7 mg, {{340}}.0{{409}}27 procent). Fraktionen 4 (10,69 g) blev adskilt med omvendt fase silicagel CC [500 g, MeOH–H2O (30:7 0,v/v)?MeOH?acetone] for at give fire fraktioner [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7.06 g), 4-3 (1,57 g) og 4-4 ​​(792,8 mg)]. Fraktionen 4-2 (1,5{{560}} g) blev underkastet HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (2{{57{{586} }}}:80, v/v)] for at give fem brøker {Fr. 4–2–1(42,9 mg), 4–2–2 [= campneosid I (17, 67.0 mg, 0.014 procent )], 4–2– 3 [= akteosid (5, 1,21 g, 0,26 procent )], 4-2-4 (41,6 mg) og 4-2-5 (181,3 mg)}. Fraktionen 4-2-4 (41,6 mg) blev yderligere oprenset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 procent vandig AcOH (18:82, v/v)] for at give isoacteosid (6, 19,1 mg, 0,0040 procent) og cis-acteosid (7,3,4 mg, 0,0007 procent). Fraktionen 4-3 (1,57 g) blev oprenset ved HPLC[Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (20:80, v/v)] for at give 11 fraktioner [Fr. 4-3-1 (30,4 mg), 4-3-2 (55,2 mg), 4-3-3 (= 17,22,1 mg, 0,0010 procent), 4-3-4 (= 5 , 224,6 mg, 0,010 procent), 4-3-5 (27,4 mg), 4-3-6 (43,6 mg), 4-3-7 (= 6, 825,0 mg, 0,037 procent), 4-3 –8 [= syringa lide A 30-OaL-rhamnopyranosid (16, 37,6 mg, 0,0017 procent )], 4–3–9(39,8 mg), 4–3–10 [{{310} }acetylacteosid (8, 85,4 mg, 0,0038 procent)], og 4-3-11 (64,6 mg)]. Fraktionen 4-3-6 (43,6 mg) blev yderligere oprenset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 procent vandig AcOH (18:82, v/v)] for at give kankanosider H1 (1, 17,0 mg, 0,0008 procent) og H2 (2,3,3 mg, 0,0001 procent). Fraktionen 4-3-9 (39,8 mg) blev yderligere oprenset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 procent vandig AcOH (18:82, v/v)] for at give kankanosid I (3, 15,4 mg, 0,0007 procent) og 6 ( 3,1 mg, 0,0001 procent). Fraktionen 5 (8,84 g) blev adskilt med omvendt fase silicagelCC [400 g, MeOH–H2O (20:80-30:70, v/v)?MeOH?acetone] for at give syv fraktioner [Fr. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) og 5 –7 (130,1 mg)]. Fraktionen 5-1 (870,2 mg) blev oprenset ved HPLC [Cos mosilpNAP, CH3CN-1 procent vandig AcOH (5:95, v/v)] for at give koffeinfri lakteosid (9, 5,1 mg, 0,0002 procent) og cistanosid F ( 20, 8,1 mg, 0,0004 procent). Fraktionen 5-3 (3,72 g) blev oprenset ved HPLC [Cosmosil5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (15:85, v/v)] for at give seks fraktioner [Fr. 5-3-1 (128,6 mg), 5-3-2 [= kankanose (21, 9,4 mg, 0,0004 procent )], 5-3-3 (64,6 mg), 5-3-4 (72,3 mg), 5-3-5 [= echinaco-side (4, 2,54 g, 0,11 procent) og 5-3-6 (318,5 mg)]. Fraktionen 5-3-4 (72,3 mg) blev yderligere oprenset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 procent vandig AcOH (10:90, v/v)] for at give campneosid II (18,10,6 mg, 0,0005 procent). Fraktionen 5-4 (979,9 mg) blev oprenset ved HPLC[Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (15:85, v/v)] til givenin-fraktioner [Fr. 5-4-1 (28,6 mg), 5-4-2 (90,5 mg), 5-4-3 (99,7 mg), 5-4-4 (= 4, 25,7 mg, 0,0012 procent), 5 –4–5 (16,4 mg), 5–4–6 (318,5 mg), 5–4–7 (21,6 mg), 5–4–8 (= 5, 204,4 mg, 0,0091 procent) og 5– 4-9 (134,7 mg)]. Fraktionen 5-4-6 (318,5 mg) blev oprenset ved HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN-1 procent vandig AcOH (15:85, v/v)] for at give cistantubulosider B1 (11, 44,9 mg, 0,0020 procent), B2 (12). , 7,6 mg, 0,0003 procent) og A (15, 21,1 mg, 0,0009 procent) og wiedemanninosid C(14, 17,2 mg, 0,0008 procent). Fraktionen 5-5 (1,19 g) blev oprenset ved HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (18:82, v/v)] for at give tubulosid A (10, 300,3 mg, 0,013 procent) og arenariosid (13,5,8 mg, 0,0006 procent). Fraktion 6 (12,52 g) blev adskilt med omvendt fase silicagel CC [600 g, MeOH-H2O (20:80-30:70, vol/vol)-MeOH-acetone] for at give fire fraktioner [Fr. 6-1 (553,8 mg), 6-2 (10,69 g), 6-3 (1,40 g) og 6-4 (17,8 mg)]. Fraktionen 6-2 (500,0 mg) blev oprenset ved HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN-1 procent vandig AcOH (25:75, v/v)] for at give 4 (353,1 mg, 0,34 procent) ).

3.3.1. Kankanoside H1 (1)

Et hvidt pulver, ½a- 24D -45.3 (c 1,06, MeOH). Højopløsnings-positiv-ion-FABMS: Beregnet for C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Fundet: 835,2633. UV [MeOH, nm (log e)]: 226 (4,33), 293 (sh, 4,36), 317 (4,52). IR (KBr): 3416, 1736, 1638, 1605, 1518, 1070,1044 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: angivet i tabel 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: givet i tabel 3. Positiv-ion FABMS: m/z 835 (M plus Na) plus. Negativ-ion FABMS: m/z 811 (MH)-.

3.3.2. Kankanoside

H2 (2) Et hvidt pulver, ½a- 25D-52.4 (c 0.27, MeOH). Højopløsnings positiv-ion FABMS: Beregnet for C37H48O20Na (M plus Na) plus: 835,2637. Fundet: 835,2644. UV [MeOH, nm (log e)]: 228 (4,26), 290 (sh, 4,22), 316 (4,37). IR (KBr): 3420, 1717, 1638, 1605, 1508, 1159, 1067 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: angivet i tabel 2. 13C NMR (150 MHz, CD3OD) dC: givet i tabel 3. Positiv-ion FABMS: m/z 835 (M plus Na) plus .Negative-ion FABMS : m/z 811 (MH)-.

3.3.3. Kankanoside I (3)

Et hvidt pulver, ½a-25D-62.2 (c 1.00, MeOH). Højopløsnings-positiv-ion-FABMS: Beregnet for C35H46O18Na (M plus Na) plus: 777,2581. Fundet: 777,2585. UV [MeOH, nm (log e)]: 246 (3,97), 295 (sh, 4,04), 334 (4,23). IR (KBr): 3415, 1717, 1647, 1603, 1508, 1070,1046 cm-1. 1H NMR (600 MHz, CD3OD) d: angivet i tabel 2. 13CNMR (150 MHz, CD3OD) dC: givet i tabel 3. Positiv-ion FABMS: m/z 777 (M plus Na) plus. Negativ-ion FABMS: m/z 753 (MH)-.

3.4. Alkalisk og sur hydrolyse af 1–3

Opløsninger af 1, 2 og 3 (hver 1,5 mg) i 5 procent vandig kaliumhydroxid (KOH, 0,5 ml) blev omrørt ved 40 grader i 1 time. Hver opløsning blev neutraliseret med Dowex HCR W2 (H plus form), og harpikserne blev fjernet ved filtrering. Afdampning af opløsningsmidlet under reduceret tryk gav de tilsvarende deacylerede produkter, som blev underkastet HPLC-analyse [kolonne: Cosmosil pNAP,250 - 4.6 mm id; mobil fase: CH3CN–1 procent vandig AcOH (15:85, v/v); detektion: UV (254 nm); flowhastighed: 1,0 mL/min] skal identificeres som trans-koffeinsyre (tR 9,9 min fra 3), trans-p-cumarsyre (tR 17,1 min fra 1) og cis-p-cumarsyre (tR17,8 min fra 2). Derefter blev hver opløst i 1.0 MHC1 (1.0 ml) og opvarmet ved 80 C i 3 timer. Efter afkøling blev reaktionsblandingen neutraliseret med Amberlite IRA-400 (OH-form), og harpikserne blev fjernet ved filtrering. Efter fjernelse af opløsningsmidlet under reduceret tryk blev remanensen separeret af Sep-Pak C18 patronsøjlen (H2O?MeOH). Den H2O-eluerede fraktion blev underkastet HPLC-analyse under følgende betingelser: HPLC-søjle, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id - 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Japan); detektion, optisk rotation[Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Japan); mobil fase,CH3CN-H2O (85:15, v/v); strømningshastighed 0,8 ml/min]. Identifikation af L-rhamnose (i) og D-glucose (ii) frigivet fra 1, 2 eller 3 i den H2O-eluerede fraktion blev udført ved sammenligning af deres retentionstider og optiske rotation med dem for autentiske prøver [i,tR 9,9 min. (negativ)] og [ii, tR 17,9 min (positiv)].

3.5. Bioassay

3.5.1. Reagenser

LPS (fra Salmonella enteritidis), minimum essential medium (MEM) og William's E medium blev købt fra Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, USA); føtalt bovint serum (FBS) var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); og andre kemikalier var fra Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd (Osaka, Japan). 96-Mikroplader blev købt hos Sumitomo Bakelite Co.,Ltd (Tokyo, Japan).

3.5.2. Dyr

ddY-hanmus blev købt fra Kiwa Laboratory AnimalCo., Ltd, (Wakayama, Japan). Dyrene blev anbragt ved en konstant temperatur på 23 ± 2 C og blev fodret med en standard laboratoriefoder (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japan). Alle forsøgene blev udført med mus ved bevidsthed, medmindre andet er angivet. Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Forsøgsdyrsforskningsudvalget ved Kinki University.

3.5.3. Beskyttende virkning på D-GalN/LPS-induceret leverskade hos mus

Metoden beskrevet af Tiegs et al.51 blev modificeret og brugt til dette eksperiment. Kort fortalt fastede ddY-hanmus med en vægt på omkring 25-30 g i 20 timer før eksperimentet. D-GalN (350 mg/kg) og LPS (10 lg/kg) opløst i saltvand blev injiceret intraperitonealt for at fremkalde leverskade. Hver testprøve blev givet oralt 1 time før D-GalN/LPS-injektionen. Blodprøver blev opsamlet fra den infraorbitale venøse plexus 10 timer efter D-GalN/LPS-injektion. sAST- og sALT-niveauer blev bestemt ved hjælp af Reitman-Frankel-metoden (kommercielt kit, Transaminase CII-Test Wako, Wako Pure ChemicalIndustries, Co., Ltd). Hydrocortison blev anvendt som referenceforbindelse. Testprøver blev suspenderet med 5 procent arabisk gummiopløsning, og opløsningen blev administreret oralt med 10 ml/kg i hvert forsøg, mens vehiklet blev givet oralt med 10 ml/kg i den tilsvarende kontrolgruppe.

3.5.4. Beskyttende virkning på cytotoksicitet induceret af D-GalN inprimært dyrkede musehepatocytter

Den hepatobeskyttende virkning af bestanddelene blev bestemt af {{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) ) kolorimetrisk assay under anvendelse af primære dyrkede muse-hepatocytter.33-43 Hepatocytter blev isoleret fra maleddY-mus (30-35 g) ved kollagenase-perfusionsmetoden. En cellesuspension ved 4 - 104 celler i 100 l William's E-medium indeholdende FBS (10 procent), penicillin G (100 enheder/ml) og streptomycin (100 lg/ml) blev inokuleret i en 96-brønd mikroplade og fordyrket i 4 timer ved 37 grader under en atmosfære på 5 procent CO2. Mediet blev tilsat 100 l af det friske medium indeholdende D-GalN (2 mM) med eller uden testprøven, og hepatocytterne blev dyrket i 44 timer. Mediet blev udskiftet med 100 µl af det friske medium, og 10 µl MTT [5 mg/ml i phosphatpufret saltvand (PBS)]-opløsning blev tilsat til mediet. Efter 4 timers inkubation blev mediet fjernet, og 100 µl isopropanol indeholdende 0,04 M HCI blev derefter tilsat for at opløse det dannede formazan i cellerne. Den optiske densitet (OD) af formazanopløsningen blev målt med en mikropladelæser ved 570 nm (reference: 655 nm). Inhibering (procent) blev opnået ved følgende formel.

Hæmning ( procent )= [(OD(prøve) - OD(kontrol))/(OD(normal)-OD(kontrol))] x 100

3.5.5. Effekter på produktionen af ​​NO i LPS-stimulerede museperitoneale makrofager

En screeningstest for NO-produktion under anvendelse af TGC-inducerede peritoneale musemakrofager blev udført som tidligere beskrevet.43,46,

3.5.6. Effekter på produktionen af ​​TNF-a i LPS-stimulerede museperitoneale makrofager

TNF-a frigivet i mediet blev bestemt som beskrevet tidligere28 med en lille modifikation. Kort fortalt blev TGC-inducerede muse-peritoneale makrofager (5 - 105 celler/brønd) opsamlet fra peritonealhulerne hos ddY-hanmus, suspenderet i 100 l RPMI 1640 suppleret med 5 procent FBS, penicillin (100 enheder/enheder) ml) og streptomycin (100 lg/ml) og fordyrket i 96-brønds mikroplader ved 37 grader i 5 procent CO2 i luften i 1 time. Ikke-vedhæftende celler blev fjernet ved vask med PBS, og 100 µl frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af testforbindelse blev tilsat. Efter 10 minutter blev 100 µl af mediet indeholdende 10 µg/ml LPS tilsat og inkuberet i 4 timer. TNF-a-produktion i hver brønd blev bestemt under anvendelse af et ELISA-kit (Muse TNF-a ELISA-kit, Invitrogen). Hver testforbindelse blev opløst i DMSO, og opløsningen blev tilsat til mediet (endelig DMSO-koncentration 0,5 procent)

3.5.7. Hæmmende virkninger på TNF-a-induceret celledød i L929-celler

L929-celler (Dainippon Pharmaceuticals, Osaka, Japan) blev opretholdt i Minimum Essential Medium Eagle (MEM, Sigma-Aldrich) indeholdende 10 procent FBS, 1 procent MEM ikke-essentielle aminosyrer (Invitrogen), penicillin G (100 enheder) /ml) og streptomycin (100 lg/ml) ved 37 C under en 5% CO2-atmosfære. Cellerne blev inokuleret i en 96-brøndvævskulturplade [3 -104 celler/brønd i 100 l/brønd i MEM]. Efter 44 timers inkubation i mediet TNF-a (20 ng/ml) med eller uden testprøven blev cellernes levedygtighed vurderet ved MTT kolorimetrisk assay (videante). 49,50 Hver testforbindelse blev opløst i DMSO, og opløsningen blev tilsat til mediet (slutkoncentration i DMSO0,5 procent).

3.6. Statistikker

Værdier er udtrykt som middel ± SEM Envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Dunnetts test blev brugt til statistisk analyse. Sandsynlighedsværdier (p) mindre end 0.05 blev betragtet som signifikante.

Anerkendelser

TM, KN og OM blev støttet af et Grant-in-Aid for Scientific Research fra 'High-tech Research Center' Project for PrivateUniversities: matchende fondstilskud fra en Grant-in-Aid for Scientific Research fra Ministeriet for Undervisning, Kultur , Sports,Science and Technology (MEXT) i Japan, 2007-2011 og også støttet af en Grant-in-Aid for Scientific Research fra MEXT. MYog HM blev støttet af det 21. COE-program, Academic Frontier Project og en Grant-in-Aid for videnskabelig forskning fra MEX

Fra: 'Acyleretphenylethanoidoligoglycosider med hepatobeskyttende aktivitet fra ørkenplantenCistanche tubulosa' vedToshio Morikawa et al

---Bioorganisk & Medicinal Chemistry 18 (2010) 1882–1890.