Aktiv overgang af frygthukommelsesfase fra rekonsolidering til udryddelse gennem ERK-medieret forebyggelse af rekonsolidering

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hentning affrygthukommelseinducerer to modsatte hukommelsesprocesser, dvs. rekonsolidering og ekstinktion. Kort genfinding fremkalder rekonsolidering for at bevare eller forstærke frygthukommelse, mens langvarig hentning slukker denne hukommelse. Selvom mekanismerne for rekonsolidering og ekstinktion er blevet undersøgt, er det stadig ukendt, hvordan frygthukommelsesfaser skiftes fra rekonsolidering til ekstinktion under hukommelseshentning. Her viser vi, at en ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK)-afhængig hukommelsesovergangsproces efter genfinding regulerer skiftet af hukommelsesfaser fra rekonsolidering til ekstinktion ved at forhindre induktion af rekonsolidering i en inhibitorisk undgåelse (IA) opgave hos hanmus. For det første blev overgangshukommelsesfasen, som annullerer induktionen af ​​rekonsolidering, men er utilstrækkelig til erhvervelse af ekstinktion, identificeret efter rekonsolidering, men før ekstinktionsfaser. For det andet rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaserne efterhukommelsessøgningviste distinkte molekylære og cellulære signaturer gennem cAMP-responsivt element-bindende protein (CREB) og ERK-phosphorylering i amygdala, hippocampus og mediale præfrontale cortex (mPFC). Rekonsolideringsfasen viste øget CREB-phosphorylering, mens ekstinktionsfasen viste flere neurale populationer med forskellige kombinationer af CREB og/eller ERK-phosphorylering i disse hjerneområder. Interessant nok viste de tre hukommelsesfaser, inklusive overgangsfasen, forbigående ERK-aktivering umiddelbart efter hentning. Vigtigst er det, at blokaden af ​​ERK i amygdala, hippocampus eller mPFC i overgangshukommelsesfasen deinhiberede rekonsolidering-induceret forbedring af IA-hukommelse. Disse observationer tyder på, at ERK-signalvejen aktivt regulerer overgangen af ​​hukommelsesfasen fra rekonsolidering til ekstinktion, og denne proces fungerer som en switch, der annullerer rekonsolidering af frygthukommelse.

Nøgleord: ERK; udryddelse; frygthukommelse; rekonsolidering; overgang

1Department of Bioscience, Fakultet for Biovidenskab, Tokyos landbrugsuniversitet, Tokyo 156-8502, Japan og

2Graduate School of Agriculture and Life Sciences, University of Tokyo, Tokyo 113-8657, Japan

Betydningserklæring

Hentning af frygthukommelseinducerer to modsatte hukommelsesprocesser; rekonsolidering og udryddelse. Rekonsolidering fastholder/forstærkerfrygthukommelse, mens udryddelse svækker frygthukommelsen. Det er stadig ukendt, hvordan hukommelsesfaser skiftes fra rekonsolidering til ekstinktion under hentning. Her identificerede vi en aktiv hukommelsesovergangsproces, der fungerer som en switch, der hæmmer rekonsolidering. Denne hukommelsesovergangsfase viste en forbigående stigning af ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) phosphorylering i amygdala, hippocampus og mediale præfrontale cortex (mPFC). Interessant nok desinhiberede inhibering af ERK i disse regioner i overgangsfasen den rekonsolideringsmedierede forbedring af inhibitorisk undgåelse (IA) hukommelse. Disse resultater tyder på, at overgangshukommelsesprocessen aktivt regulerer skiftet af frygthukommelsesfaser af frygthukommelse ved at forhindre induktion af rekonsolidering gennem aktiveringen af ​​ERK-signalvejen.

Introduktion

Hukommelsegenfinding er ikke en passiv proces, men er snarere en dynamisk proces, der tillader vedligeholdelse, styrkelse, svækkelse eller ændring/opdatering af en original hukommelse (Misanin et al., 1968; Schneider og Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. ., 1979; Gordon, 1981; Nader et al., 2000; Nader og Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima et al., 2014). Det er vigtigt, at en hentet betinget frygthukommelse ved kort genudsættelse for den betingede stimulus (CS) bliver labil og kræver genekspressionsafhængig rekonsolidering for at opretholde eller forstærke den (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Tronel et al., 2005; Fukushima et al., 2014). Omvendt inducerer kontinuerlig eller gentagen genudsættelse for CS hukommelsesudryddelse, hvilket svækker frygthukommelsen (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers og Davis, 2002). Således inducerer genfinding af frygthukommelse to modsatte hukommelsesprocesser, dvs. rekonsolidering og ekstinktion, selvom begge processer induceres ved gen-eksponering for en identisk CS, men adskiller sig i henhold til varigheden af ​​re-eksponering for CS.

Det fælles og kritiske biokemiske træk ved rekonsolidering og ekstinktion er kravet om cAMP-responsive element-binding protein (CREB)-medieret genekspression (Mamiya et al., 2009). Interessant nok har vi vist kontrasterende molekylære, anatomiske og adfærdsmæssige signaturer mellem rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne af kontekstuel frygthukommelse (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Blokering af proteinsyntese under rekonsolideringsfasen forstyrrer den oprindelige frygthukommelse, hvorimod blokering af proteinsyntese under udryddelsesfasen ikke gør dette, selvom den kontekstuelle frygthukommelse blev reaktiveret. Kravet om hjerneregioner, der viser aktiveringen af ​​CREB-medieret genekspression, er forskelligt mellem rekonsolidering og ekstinktion; rekonsolidering afhænger af amygdala og hippocampus, hvorimod ekstinktion afhænger af amygdala og mediale præfrontale cortex (mPFC). Imidlertid adskiller tidsforløbet af amygdaloid CREB-aktivering sig mellem rekonsoliderings- og ekstinktionshukommelsesfaserne. Disse observationer antydede, at rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne ikke er uafhængige, men snarere interagerer med hinanden. Interessant nok har nyere undersøgelser identificeret et tidsvindue (overgangsfase), der ikke viser nogen ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) aktivering i amygdala efter rekonsolidering, men før udryddelsesfaserne efter genfinding af auditiv frygthukommelse (Merlo et al., 2018) ). Tilsammen antyder disse resultater de mulige mekanismer, hvormed hukommelsesfaser skiftes fra rekonsolidering til udryddelse under genfinding af frygthukommelse. Med andre ord er det muligt, at hukommelsesovergangsprocessen aktivt regulerer denne switch.

I en opgave med hæmmende undgåelse (IA) får mus et elektrisk fodstød, efter at de kommer ind i et mørkt rum fra et let rum og dannerhukommelsefor at undgå det mørke rum. Tidligere viste vi ved at bruge denne opgave, at rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne kan skelnes på det tidspunkt, hvor en mus kommer ind i et mørkt rum fra et lys rum under en geneksponeringssession (Fukushima et al., 2014). Derfor giver denne opgave os mulighed for at karakterisere de perspektiviske molekylære signaturer af rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne, i modsætning til det klassiske kontekstuelle frygtkonditioneringsparadigme, hvor reaktiveringen af ​​betinget frygthukommelse ved re-eksponering for CS initierer både rekonsolidering og ekstinktion; kort (3 min) genudsættelse for den betingede kontekst inducerer rekonsolidering, hvorimod lang (30 min) eller gentagen genudsættelse for denne kontekst inducerer ekstinktion (Eisenberg et al., 2003; Pedreira og Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee et al., 2008; Mamiya et al., 2009). Desuden fandt vi ud af, at den hentede IA-hukommelse forbedres gennem hukommelsesrekonsolidering i denne opgave (Fukushima et al., 2014).

At forstå mekanismen for overgangen fra rekonsolidering til udryddelse under genfinding af frygthukommelse, sigtede vi på at identificere og karakterisere de molekylære, cellulære og adfærdsmæssige signaturer af rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaserne af IA-hukommelse. Vi analyserede aktiveringen af ​​CREB og ERK i amygdala, hippocampus og mPFC i rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaserne og undersøgte rollerne for ERK-aktivering i disse hukommelsesprocesser.

Materialer og metoder

Mus Alle eksperimenter blev udført i henhold til vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr (Japan Neuroscience Society og Tokyo University of Agriculture). Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved Tokyo University of Agriculture (autorisation #280037). Alle kirurgiske indgreb blev udført under Nembutal anæstesi, og der blev gjort alt for at minimere lidelse. C57BL/6N-hanmus blev opnået fra Charles River. Musene blev anbragt i bure på fem eller seks, holdt på en 12/12 timers lys/mørke-cyklus og gav adgang til mad og vand ad libitum. Musene var mindst otte uger gamle, da de blev testet. Test blev udført under den lette fase af cyklussen. Alle eksperimenter blev udført blindt for musenes behandlingstilstand.

IA-test. Gennemgangs IA-apparatet (OHARA Pharmaceutical) bestod af en kasse med separate lyse og mørke rum (begge 15,5 12,5 11,5 cm). Lysrummet blev oplyst af et fluorescerende lys (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016). Før påbegyndelsen af ​​IA-træning blev musene håndteret individuelt i 2 minutter hver dag i en uge. Under træningssessionerne fik hver mus lov til at vænne sig til det lyse rum i 30 s, og guillotinedøren blev hævet for at give adgang til det mørke rum. Latency til at komme ind i det mørke rum blev betragtet som et mål for erhvervelse. Så snart musen var kommet ind i det mørke rum, blev guillotinedøren lukket. Efter 5 s blev der afgivet et fodchok (0,2 mA) i en samlet periode på 2 s (træning). 24 timer efter træningssessionen blev musen placeret tilbage i det lyse rum, indtil den kom ind i det mørke rum (gennemsnitlig 459 6 15.49 s). Umiddelbart efter at musen var kommet ind i det mørke rum, blev guillotinedøren lukket, og musen opholdt sig i det mørke rum i et varierende tidsrum (0, 1 eller 10 min) uden fodchok (genaktivering). Hukommelse blev vurderet 48 timer senere [postreaktivering langtidshukommelse (PR-LTM) test] som crossover latensen for musen til at komme ind i det mørke rum, når det blev udskiftet i det lyse rum, som ved reaktivering.

Til det første eksperiment undersøgte vi effekten af ​​proteinsyntesehæmning efter reaktivering (genudsættelse for det mørke rum i 0, 1 eller 10 min; Fig. 1). Proteinsyntesehæmmeren anisomycin (ANI; Wako) blev opløst i saltvand (pH justeret til 7,0-7,4 med NaOH). Musene blev trænet som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere modtog de vehikel (VEH) eller ANI (150 mg/kg, ip) umiddelbart efter genudsættelse for det mørke rum i 0, 1 eller 10 minutter uden fodchok (genaktivering). Ved denne dosis hæmmer ANI 0,90 procent af proteinsyntesen i hjernen i løbet af de første 2 timer (Flood et al., 1973). 48 timer efter reaktiveringssessionen blev individuelle mus igen anbragt i lysrummet, og crossover latens blev vurderet.

Til det andet eksperiment [phosphoryleret CREB (pCREB) og phosphoryleret ERK (pERK) immunhistokemi; Fig. 2-5], undersøgte vi hjerneregionerne, der blev aktiveret efter genudsættelse for lyset (indtil musene kom ind i det mørke rum, genudsættelse for det mørke rum i 0 min) eller mørke rum (gen- eksponering for det mørke rum i 1 eller 10 min.). Musene blev opdelt i fire Fukushima et al. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 10. februar 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289grupper. 24 timer efter træning blev individuelle mus genudsat for det lyse rum og blev derefter i det mørke rum efter deres indtræden fra det mørke rum [genaktivering: 0 min i det mørke rum, rekonsolidering (Recon) gruppe; 1 min, overgangs (Tran) gruppe; 10 min, ekstinktion (Ext) gruppe]. En anden gruppe mus blev ikke returneret til det lyse/mørke rum [ikke-reaktiveret (NR) gruppe]. Musene blev derefter bedøvet med Nembutal (750 mg/kg, ip) 5, 15 eller 30 minutter efter reaktivering.

Til det tredje eksperiment (mikroinfusion af U0126; fig. 6,7) undersøgte vi virkningerne af ERK-hæmning i amygdala, hippocampus eller mPFC påhukommelserekonsolidering/forstærkning, overgang og udryddelse. MEK-hæmmeren U0126 (Sigma-Aldrich) blev opløst i kunstig cerebrospinalvæske indeholdende tre dråber Tween 80 (Sigma) i 2,5 ml 7,5 procent dimethylsulfoxid (Wako) og justeret til pH 7,4 med NaOH. Musene blev trænet som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere blev de placeret tilbage i lysrummet (genaktivering). Musene blev mikroinfunderet med U0126 (1 mg) eller VEH i de forskellige hjerneområder umiddelbart efter (fig. 6A, C, E–H, 7A–C) eller 30 min. (fig. 6B, D) reaktivering. 48 timer efter reaktivering blev individuelle mus igen placeret i det lette rum, og crossover latens blev vurderet (PR LTM). Mikroinfusioner i hippocampus og mPFC (0,5 ml) blev foretaget med en hastighed på 0,25 ml/min. Mikroinfusioner i amygdala (0,2 ml) blev foretaget med en hastighed på 0,1 ml/min. Injektionskanylen blev efterladt på plads i 2 minutter efter mikroinfusion, og musene blev derefter returneret til deres hjemmebure. MEK-hæmmeren SL327 (Santa Cruz Biotechnology) blev opløst i dimethylsulfoxid og fortyndet med saltvand. Musene blev trænet som beskrevet ovenfor, og 24 timer senere blev individuelle mus placeret tilbage i lysrummet (reaktivering). Musene blev systemisk injiceret med SL327 (10 eller 20 mg/kg) eller VEH umiddelbart efter reaktivering (fig. 7D-F). 48 timer efter reaktivering blev individuelle mus igen anbragt i det lette rum, og crossover latens blev vurderet (PR-LTM).

Immunhistokemi blev udført som beskrevet tidligere (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Efter bedøvelse blev alle mus perfunderet med 4 procent paraformaldehyd. Hjernerne blev fjernet, fikseret natten over, overført til 30 procent saccharose og opbevaret ved 4 grader. Koronale sektioner (30 mm) blev skåret i en kryostat.

Til pCREB- og pERK-farvning blev fritflydende sektioner behandlet med 1 procent H2O2 og inkuberet natten over med et kanin polyklonalt anti-phospho-CREB (serin 133; S133) antistof (1:1000; #{{10 }}, Millipore) og/eller kanin monoklonalt anti-phospho-ERK1/2 (T202/Y204) antistof (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) i blokerende opløsning (phosphatbufret saltvand plus 1 procent gedeserumalbumin, 1 mg/ml bovint serumalbumin og 0,05 procent Triton X-100). Sektionerne blev vasket med phosphatpufret saltvand og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret æsel-anti-kanin-IgG (1:500; Jackson ImmunoResearch) for pCREB eller peberrodsperoxidase-konjugeret ged-anti-kanin-IgG for pERK i 1 time ved stuetemperatur. pCREB-signaler blev amplificeret af biotin-tyramid og visualiseret ved hjælp af Alexa Fluor-konjugeret streptavidin (Invitrogen). pERK-signaler blev forstærket med TSA-FCM (Invitrogen). Sektionerne blev monteret på objektglas og dækglas under anvendelse af et monteringsmedium (Millipore).

Kvantificering blev udført som beskrevet tidligere (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008). Strukturer blev defineret anatomisk ifølge Franklin og Paxinos' atlas (1997). Alle immunreaktive neuroner blev talt af en forsøgsleder, der var blind for behandlingstilstanden

Resultater

Karakterisering af hukommelsesfaser efter hentning i IA-opgaven

IA-opgaven giver os mulighed for at skelne rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne på det tidspunkt, hvor en mus kommer ind i et mørkt rum fra et lyst rum (Fukushima et al., 2014). For at forstå den mekanisme, der ligger til grund for skiftet af hukommelsesfaser fra rekonsolidering til ekstinktion, karakteriserede vi IA-hukommelsesfaserne efter hukommelseshentning ved at undersøge virkningerne af at hæmme proteinsyntesen, der er nødvendig for rekonsolidering og ekstinktion af IA-hukommelse (Fukushima et al., 2014). Musene blev først anbragt i lysrummet. 5 s efter at de kom ind i det mørke rum, blev der afgivet et kort elektrisk fodstød (træning). Musene blev genudsat for det lyse rum 24 timer efter træningen (genaktiveringssession; Fig. 1A), og deres crossover-latens for at komme ind i det mørke rum blev vurderet (Fig. 1B). Musene blev returneret til deres hjemmebure umiddelbart efter, at de kom ind i det mørke rum fra det lyse rum (0-min. genudsættelse for det mørke rum; rekonsolideringsfase) eller blev i det mørke rum i 1, 3 eller 10 min uden at modtage et fodchok (udryddelsesfase; Fig. 1C–E). Umiddelbart efter reaktiveringssessionen modtog musene en systemisk injektion af VEH eller proteinsyntesehæmmeren ANI. 48 timer senere blev crossover latens vurderet PR-LTM.

I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse (Fukushima et al., 2014) inducerede geneksponering for lysrummet (0 min gruppe) rekonsolidering og forbedring af IA-hukommelsen. En tovejs ANOVA afslørede signifikante virkninger af tid (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), lægemiddel (F(1) ,24)=23.197, p , 0,0001) og tid lægemiddelinteraktion (F(1,24)=25.022, p , 0,0001; Fig. 1B). Post hoc Bonferronis test og parrede t-test afslørede, at VEH- og ANI-grupperne viste signifikant øget henholdsvis nedsat crossover-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringssessionen (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; Fig. 1B). Disse observationer indikerer, at IA-hukommelseshentning i lysrummet forbedrede hukommelsen, mens proteinsyntesehæmning forstyrrede den hentede hukommelse, hvilket bekræfter den tidligere observation, at IA-hukommelseshentning forbedrer hukommelsen gennem rekonsolidering på en proteinsynteseafhængig måde.

I modsætning hertil inducerede geneksponeringen for det mørke rum langsigtet ekstinktion [tovejs ANOVA, tid (Fig. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Fig. 1D, F(1,36)=11.699, s=0.0016), lægemiddel (Fig. 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; Fig. 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), tid lægemiddelinteraktion (Fig. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; Fig. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, s.=0.0079)], som tidligere observeret (Fukushima et al., 2014). VEH-grupperne, der opholdt sig i det mørke rum i 3 eller 10 minutter, viste signifikant reduceret cross-over-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringssessionen, hvorimod ANI-grupperne viste sammenlignelig crossover-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringssessionen og VEH-grupper (post hoc Bonferronis test, ps , 0,05; parret t-test, Fig. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, s. 0,05; Fig. 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1.02, s. 0,05 ). Disse observationer indikerer, at genudsættelse for det mørke rum i 3 eller 10 minutter slukkede IA-hukommelsen, og at inhibering af proteinsyntese blokerede langsigtet ekstinktion. IA-hukommelseshentning i det mørke rum slukker således IA-hukommelsen på en genekspressionsafhængig måde.

Det er vigtigt, at VEH-gruppen viste sammenlignelig cross-over-latens ved PR-LTM sammenlignet med reaktiveringssessionen og med ANI-gruppen, da de opholdt sig i det mørke rum i 1 min [tovejs ANOVA, tid (F(1,36) {{ 5}}.03, s. 0.05), lægemiddel (F(1,36)=0.019, s. 0.05), tid lægemiddelinteraktion (F(1,36)=0.011, s. 0.05); post hoc Bonferronis test, ps. 0,05; parret t-test, VEH, t(9)=0.091, s . 0,05, ANI, t(9)=0.328, s . 0,05; Fig. 1E]. Disse observationer indikerer, at VEH-gruppen hverken viste forbedring eller udryddelse af IA-hukommelse, og at ANI-gruppen ikke viste nogen forstyrrelse af IA-hukommelse. Derfor blokerede geneksponering for det mørke rum i 1 min både forbedringen og ANI-induceret afbrydelse af den reaktiverede IA-hukommelse, men ikke slukkede IA-hukommelsen, hvilket tyder på, at denne 1-min. geneksponering annullerer induktionen af ​​rekonsolidering , men er utilstrækkelig til at slukke IA-hukommelsen.

Sammenfattende indikerede disse resultater, at genudsættelse for det lyse rum inducerer rekonsolideringsfasen, hvorimod længere genudsættelse for det mørke rum (3 eller 10 min) inducerer ekstinktionsfasen. Endnu vigtigere er det, at ophold i 1 minut i det mørke rum inducerer overgangsfasen fra rekonsolidering til ekstinktion, hvilket hæmmer frygthukommelsesrekonsolidering uden at inducere ekstinktion.

Molekylære signaturer af rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaserne i amygdala, hippocampus og mPFC efter IA-hukommelseshentning

Genkonsolidering og ekstinktion af kontekstuel frygthukommelse viser stigninger i CREB-phosphorylering ved S133, en markør for genekspressionsaktivering, der kræves til rekonsolidering og langsigtet ekstinktion, men viser distinkt dynamik af CREB-phosphorylering (Mamiya et al., 2009 ). Interessant nok har nyere undersøgelser vist, at der ikke er nogen stigning i phosphoryleringen af ​​ERK, en opstrømsregulator af CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001) i den basolaterale region af amygdala ved overgangen fra rekonsolidering til udryddelsen af ​​en cued frygthukommelse, selvom denne fosforylering øges i den basolaterale region, når en cued frygthukommelse rekonsolideres og slukkes (Merlo et al., 2014, 2018). En anden undersøgelse indikerede, at hippocampus ERK kun aktiveres, når kontekstuel frygthukommelse er slukket, men ikke rekonsolideret (Tronson et al., 2009). Disse resultater tyder på, at rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaser viser distinkte molekylære og cellulære signaturer. Derfor målte og sammenlignede vi niveauerne af pCREB og pERK i rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaserne ved hjælp af immunhistokemi. Vi udførte lignende eksperimentelle skemaer som i figur 1B, D, E ved hjælp af fire eksperimentelle grupper. Musene blev genudsat for det lyse rum 24 timer efter træningen og blev derefter i det mørke rum [reaktivering: 0 minutter i det mørke rum, rekonsolidering (Recon) gruppe; 1 min, overgangs (Tran) gruppe; 10 min, ekstinktion (Ext) gruppe]. En anden gruppe mus blev ikke returneret til det lyse/mørke rum (ikke-reaktiveret, NR-gruppe). Vi talte pCREB-positive (pCREB1) neuroner, pERK-positive (pERK1) neuroner og dobbeltpositive (pCREB1/pERK1) neuroner i amygdala, hippocampus og mPFC 30 minutter efter reaktiveringssessionen.

Amygdala (lateral region) CREB blev aktiveret i ekstinktions- og rekonsolideringsfaserne, hvorimod ERK kun blev aktiveret i ekstinktionsfasen (fig. 2A-C). En envejs ANOVA afslørede en signifikant effekt af gruppen (fig. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). I lighed med tidligere resultater (Mamiya et al., 2009) afslørede post hoc Newman-Keuls-testen, at Recon- og Ext-grupperne viste signifikant flere pCREB1-neuroner end de andre grupper (s, 0,05). Disse observationer indikerede, at i lighed med observationerne på adfærdsniveauerne (fig. 1), annullerer eksponering for det mørke rum i 1 min (overgangsfase) "tændingen" af CREB-phosphorylering, som ville blive øget i rekonsolideringsfasen. I modsætning hertil blev der observeret signifikant flere pERK1-neuroner i Ext-gruppen end i de andre grupper, selvom der var meget færre pERK1-neuroner end pCREB1-neuroner i Ext-gruppen (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; Fig. 2C).

Konsekvent blev der observeret signifikant flere dobbelte positive neuroner (pCREB1/pERK1) i Ext-gruppen (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; Fig. 2D), hvorimod signifikant flere pCREB1/pERK- (pCREB enkelt positive) neuroner blev observeret i Recon- og Ext-grupperne (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; Fig. 2E). Således viste rekonsolideringsfasen kun en enkelt population af pCREB1/pERK– neuroner. I modsætning hertil viste ekstinktionsfasen to populationer af pCREB1/pERK- og pCREB1/pERK1-neuroner, hvilket indikerer, at ERK kun aktiveres i en undergruppe af pCREB1-neuroner. Det er vigtigt, at lignende resultater blev observeret i den basolaterale region af amygdala (fig. 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001; fig. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Fig. 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; Fig. 2J, F(3,29)=12 .505, s, 0,0001).

Bifasisk aktivering af ERK i ekstinktionsfasen ERK er en opstrøms aktivator af CREB, og derved kræves ERK-aktivering til konsolidering og rekonsolidering af frygthukommelse (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci et al., 2005). Men inkonsekvent blev der ikke observeret nogen ERK-aktivering i amygdala, hippocampus eller mPFC i rekonsolideringsfasen, når pERK blev målt 30 minutter efter reaktiveringssessionen (fig. 2-4). Derfor undersøgte vi tidsforløbene for ERK- og CREB-phosphorylering. Vi udførte et lignende eksperiment som i figur 2-4, bortset fra at pCREB- og pERK-niveauer blev målt ved 5, 15 og 30 minutter efter genaktiveringssessionen (genudsættelse for det mørke rum i {{ 66}}, 1 eller 10 min; fig. 5A). I overensstemmelse med dataene vist i figurerne 2-4 blev signifikante stigninger i pCREB1-neuroner observeret efter 30 minutter, men ikke efter 5 minutter, efter reaktiveringssessionen i Recon (amygdala, mPFC og hippocampus) og Ext (amygdala og mPFC) ) grupper, men ikke Tran-gruppen (fig. 5E, envejs ANOVA, amygdala, 5 min, F(3,23)=0.346, s. 0.05, 30 min, F(3,23)=15.272, s , 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1.169, s. 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, s , 0,0001; hippocampus, 5 min., F(3,23)=0.154, s. 0.05, 30 min., F(3,23)=16.197, s. 0,0001; uparret t-test, amygdala, rekonsolidering, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, ekstinktion, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, rekonsolidering, 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p , 0,0001, ekstinktion, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; hippocampus CA1-region, rekonsolidering, 5 vs 30 min., t(12)=2.339, s.=0.0374).

Interessant nok blev signifikante stigninger i pERK1-neuroner observeret i amygdala, mPFC og hippocampus i Recon-, Tran- og Ext-grupperne 5 minutter efter reaktiveringssessionen sammenlignet med NR-gruppen (fig. 5F, amygdala, F(3,23)=10.961, s=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, s { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, s.=0.0017). Disse observationer indikerede, at ERK aktiveres umiddelbart efter reaktiveringssessionen i alle hukommelsesfaser. Disse stigninger i antallet af pERK1-neuroner vendte imidlertid tilbage til basale niveauer (sammenlignelige med NR-gruppen) 15 minutter efter reaktiveringssessionen (fig. 5F, amygdala, F(3,20)=2.676, s. . 0,05; mPFC, F(3,23)=0.683, s. 0.05; hippocampus, F(3,20)=0.74, s. 0,05). I overensstemmelse med resultaterne vist i figurerne 2-4 blev der desuden observeret signifikant flere pERK1-neuroner i amygdala, mPFC og hippocampus 30 minutter efter reaktiveringssessionen kun i Ext-gruppen (fig. 5F, amygdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, s.=0.003). Således viser rekonsoliderings- og overgangsfaserne kun forbigående aktivering af ERK på det tidlige tidspunkt (5 min), hvorimod ekstinktionsfasen viser bifasisk aktivering af ERK på de tidlige (5 min) og sene (30 min) tidspunkter efter reaktiveringen session. Disse observationer indikerede, at mekanismerne til regulering af ERK-aktivering adskiller sig i rekonsoliderings-/overgangs- og ekstinktionsfaserne. Samlet viste vores observationer, at rekonsoliderings-, overgangs- og ekstinktionsfaserne viser distinkte molekylære signaturer.

Roller af ERK-aktivering i rekonsolidering og ekstinktionsfaser af IA-hukommelse

Rekonsoliderings-/overgangs- og ekstinktionsfaserne viste henholdsvis monofasisk og bifasisk ERK-aktivering. Vi undersøgte og sammenlignede derefter rollerne for tidlig (5 min) og sen (30 min) ERK-aktivering i mPFC'en i rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne ved at undersøge virkningerne af at hæmme ERK (fig. 6).

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi mekanismerne for hukommelsesovergang fra rekonsolidering til ekstinktionsfaser efter hentning af IA-hukommelse. Vi karakteriserede først adfærdssignaturerne af IA-hukommelsesfaser efter hentning. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse (Fukushima et al., 2014), inducerede IA-hukommelseshentning rekonsolidering og ekstinktion ved genudsættelse for lys (0 min i det mørke rum) og mørke ( 3 eller 10 min) rum, hhv. Interessant nok blev IA-hukommelsen hverken forbedret eller slukket og viste modstand mod inhibering af proteinsyntese, når musene blev genudsat for det mørke rum i kun 1 min. Derfor tyder disse observationer på, at en 1-min. gen-eksponering for det mørke rum annullerer induktionen af ​​rekonsolidering, men er utilstrækkelig til at slukke IA-hukommelsen. Desuden fandt vi, at ERK blev aktiveret i amygdala, hippocampus og mPFC på et tidligt tidspunkt (5 min) efter genudsættelse for det mørke rum i 0, 1 eller 10 min. Konsekvent blokerede hæmningen af ​​ERK i disse hjerneregioner rekonsolidering/forstærkning og udryddelse af IA-hukommelse. Vigtigst er det, at ERK-hæmning i amygdala, hippocampus og mPFC efter 1-min. gen-eksponering til det mørke rum afhæmmede den rekonsolideringsmedierede forbedring af IA-hukommelsen, hvilket tyder på, at ERK-aktivering efter korte (1 min) geneksponeringer til det mørke rum er påkrævet for at hæmme IA-hukommelsesrekonsolidering. Omvendt var en 1-min. geneksponering for det mørke rum utilstrækkelig til at slukke IA-hukommelsen, selvom forlænget geneksponering til det mørke rum (3 eller 10 minutter) slukkede denne hukommelse. Derfor tyder vores resultater på, at en 1-min. gen-eksponering for det mørke rum inducerer en hukommelsesovergangsproces, der annullerer rekonsolidering/forbedring, men ikke initierer ekstinktionslæring. Samlet foreslår vi, at hukommelsesovergangsprocessen bidrager til skiftet af hukommelsesfaser fra rekonsolidering til ekstinktion gennem ERK-medieret forebyggelse af rekonsolidering.

I lighed med vores nuværende observationer viste en nylig undersøgelse med auditiv frygtkonditionering, at enkelte (1) eller forlængede (10) CS-præsentationer inducerer henholdsvis rekonsolidering og ekstinktion af hukommelse gennem en stigning i pERK-niveauer i den basolaterale region af amygdala. I modsætning hertil ændrer mellemliggende (4-7) CS-præsentationer ikke pERK-niveauer i den basolaterale region af amygdala. Det er vigtigt, at ERK-hæmning ved de mellemliggende CS-præsentationer ikke påvirkede frygthukommelsen. Denne undersøgelse antydede, at der er en overgang i hukommelsesfasen fra rekonsolidering til udryddelse efter genfinding af frygthukommelsen (Merlo et al., 2018). I denne undersøgelse udvidede vi dette fund og foreslog, at overgangsfasen aktivt skifter hukommelsesfaser fra rekonsolidering til ekstinktion gennem aktiveringen af ​​ERK-signaltransduktionsvejen. I modsætning til tidligere fund (Merlo et al., 2018) fandt vi, at overgangsfasen involverer ERK-phosphorylering i amygdala, hippocampus og mPFC. Disse uoverensstemmelser kan være på grund af forskellen mellem tidspunkter, der undersøger ERK-phosphorylering; den tidligere undersøgelse målte pERK-niveauer ved;12 minutter efter CS-præsentation (Merlo et al., 2018), mens vores undersøgelse viste, at øgede pERK-niveauer vendte tilbage til basalniveauet omkring dette tidspunkt (15 minutter efter geneksponeringen). Derudover er det vigtigt at bemærke, at IA-opgaven muliggør observation af forbedringen af ​​IA-hukommelsen gennem rekonsolidering, hvilket fører til vores konstatering af, at inhiberingen af ​​ERK i overgangsfasen dehæmmer forbedringen af ​​IA-hukommelsen.

Tidligere undersøgelser har vist, at ERK-phosphorylering øges i den basolaterale region af amygdala ved 20-60 minutter efter ekstinktionsindlæring af cued fear memory (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), hvorimod hippocampus viser denne aktivering 1 time efter ekstinktionsindlæringen af ​​kontekstuel frygthukommelse (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). I den nuværende undersøgelse opnåede vi lignende observationer, at pERK øges 30 minutter efter reaktiveringssessionen i ekstinktionsfasen. Disse resultater tyder på, at ERK-phosphorylering er en almindelig molekylær signatur af den sene ekstinktionsfase (20-60 min).

Desuden observerede vi, at ERK-aktivering sker bifasisk på tidlige og sene tidspunkter (5 og 30 min) efter reaktiveringssessionen i ekstinktionsfasen, hvorimod denne aktivering sker monofasisk på det tidlige tidspunkt i rekonsolideringsfasen (fig. 5). . Konsekvent blokerede inhibering af ERK i hjerneregioner på disse tidspunkter af rekonsoliderings- og ekstinktionsfaserne henholdsvis rekonsolidering/forstærkning og langsigtet ekstinktion (fig. 6A, C-H). Disse observationer tyder på, at monofasisk og bifasisk ERK-aktivering er påkrævet for henholdsvis rekonsolideringsmedieret forbedring og udryddelse af IA-hukommelse. Det er vigtigt at bemærke, at ERK fungerer som en opstrømsregulator af CREB-phosphorylering. Derfor kan den forbigående aktivering af ERK i den tidlige hukommelsesfase, i det mindste delvist, bidrage til denne phosphorylering af CREB, som aktiverer ekspressionen af ​​gener, der kræves til rekonsolidering og langsigtet ekstinktion.

I lighed med vores tidligere resultater ved brug af kontekstuel frygtkonditionering (Mamiya et al., 2009), blev CREB aktiveret i rekonsolidering (amygdala/hippocampus/mPFC) og ekstinktion (amygdala/mPFC) hukommelsesfaser, mens ERK kun blev aktiveret i ekstinktionsfasen 30 minutter efter reaktiveringssessionen. Konsekvent blev kun en enkelt population af pCREB1/pERK– neuroner observeret i rekonsolideringsfasen, mens forskellige neuronpopulationer blev observeret i ekstinktionsfasen: pCREB1/pERK– og pCREB1/pERK1 neuroner i amygdala (fig. 2); pCREB-/pERK1 neuroner i hippocampus (fig. 3); og pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 og pCREB1/pERK1 neuroner i mPFC (fig. 4). Disse observationer, især den kontrasterende observation af pCREB–/pERK1 og pCREB1/pERK– neuroner, tyder på, at aktiveringen af ​​CREB og ERK reguleres forskelligt i hvert hjerneområde, når hukommelsen er slukket, og at den sene fase aktivering af ERK spiller specifik og distinkt roller for udryddelse af frygthukommelse sammenlignet med andre hukommelsesprocesser såsom konsolidering og rekonsolidering som diskuteret nedenfor. Interessant nok observerede vi, at pERK1 neuroner var mere rigelige i mPFC sammenlignet med hippocampus og amygdala, da mPFC viste et højere forhold mellem pERK1 neuroner (udryddelsesfase) og pCREB1 neuroner (rekonsolideringsfase) sammenlignet med hippocampus og amygdala, hvilket tyder på, at aktiveringen af ​​ERK i mPFC spiller en mere specifik rolle i hukommelsesudryddelse.

Det er fortsat uklart, om de samme eller forskellige populationer af neuroner aktiveres i genopbygnings-, overgangs- og ekstinktionshukommelsesfaserne. En tidligere undersøgelse identificerede aktiveringen af ​​"frygtneuroner" og "udryddelsesneuroner" i amygdala, når henholdsvis hukommelsen med signaleret frygt reaktiveres eller slukkes (Herry et al., 2008). Derfor er det muligt, at ERK og CREB aktiveres i de forskellige populationer af neuroner med forskellige tidsmæssige profiler (dvs. "rekonsolideringsneuroner" og ekstinktionsneuroner). Som diskuteret ovenfor kan pCREB1-neuroner, herunder pCREB1/pERK1-neuroner, regulere rekonsolidering og langsigtet ekstinktion af IA-hukommelse gennem aktivering af genekspression som henholdsvis rekonsoliderings- og ekstinktionsneuroner. Omvendt kan ERK-aktivering i pCREB-/pERK1-neuroner bidrage til annulleringen af ​​CREB-medieret transkriptionel aktivering, som ville være nødvendig for rekonsolidering, da denne ERK-aktivering specifikt observeres i den sene ekstinktionsfase; ERK har aktiveret i rekonsolideringsneuronerne for at annullere aktiveringen af ​​genekspression i ekstinktionsfasen. Interessant nok viste en tidligere undersøgelse, at hippocampus ERK-aktivering blokerer induktionen af ​​c-fos, når kontekstuel frygthukommelse er slukket (Guedea et al., 2011), hvilket øger muligheden for, at denne ERK-aktivering antagoniserer CREB-signalvejen. Det er vigtigt at identificere de neuronale populationer, der regulerer rekonsolidering, overgang og ekstinktion, og at undersøge de molekylære signaturer og funktionelle betydning af disse neuroner. Derudover forbliver interaktioner mellem neurale populationer identificeret i denne undersøgelse ukendt. Det er muligt, at "udryddelse (overgangs) neuroner" modulerer funktionen af ​​rekonsolideringsneuroner for at annullere forhindre rekonsolidering gennem interaktioner mellem dem (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Derfor er det også vigtigt at undersøge disse interaktioner i og mellem amygdala, mPFC og hippocampus.

Tidligere viste vi, at hippocampus ikke viser nogen ændring af CREB-phosphorylering og Arc-ekspression efter ekstinktionslæring af kontekstuel frygt, og konsekvent formår inhiberingen af ​​proteinsyntese i hippocampus i udryddelsesfasen ikke at blokere langsigtet ekstinktion (Mamiya et al. , 2009). Disse observationer har rejst muligheden for, at hippocampus ikke er nødvendig for langsigtet udryddelse. Vi viste imidlertid, at ERK aktiveres i hippocampus efter ekstinktionsindlæring af IA-hukommelse, og konsekvent forringer blokering af ERK-aktivering i hippocampus langsigtet ekstinktion. Derfor indikerer vores nuværende observationer væsentlige roller for hippocampus i hukommelsesudryddelse. Sammenholdt med vores tidligere resultater foreslår vi, at hippocampus er nødvendig for hukommelsesudryddelse, men ikke for en konsolideringslignende proces for at stabilisere en "udryddelseshukommelse" gennem aktivering af genekspression.