Første del Acteosid undertrykt Microglia M1-polarisering gennem hæmmet NF-KB-signalvej og AMPK-medieret mitokondrierfunktionsgendannelse

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

DEL 1 Hvordan øger Cistanche Acteosider hjernecellernes vitalitet og lindrer Alzheimers sygdom?

Klik for at Cistanches produkter

Ying-Qi Li Kinas farmaceutiske universitet

Yi Chen China Pharmaceutical University

Si-Qi Jiang China Pharmaceutical University

Yuan-Yuan Shi China Pharmaceutical University

Xiao-Li Jiang China Pharmaceutical University

Shan-Shan Wu China Pharmaceutical University

Ping Zhou China Pharmaceutical University

Hui-Ying Wang China Pharmaceutical University

Ping Li China Pharmaceutical University

Forskningsnøgleord: akteosid, BV-2-celler, metabolisme, RNA-seq, mitokondrier, neuroin§amation

Abstrakt

Baggrund: Alzheimers sygdom (AD) er den hyppigste form for demens. Mensakteosid(ACT), en forbindelseisoleretfraCistanche tubulosa, besidderneurobeskyttende egenskaber. Imidlertid forbliver den underliggende mekanisme til regulering af mikroglia-polarisering dårligt defineret. Metoder: Heri blev den AlCl3-inducerede AD-model i zebra¦sh-larver anvendt for at afdække den terapeutiske effekt af ACT. BV-2-celler blev brugt til at demonstrere rollen af ​​ACT på mikroglia-polarisering. RNA-sekvens, HPLC-Q-TOF-MS, western blot og molekylær docking blev kombineret for at bekræfte dens mekanisme.

Resultater: ACT forbedrede signifikant den eksperimentelle dyskinesi og nervesystemlidelser hos zebra. Efterfølgende undertrykte det M1-polarisering og fremmede M2-fænotypen i LPS-inducerede BV-2-celler. Vi demonstrerede først, at ACT udøvede dyb transkriptomisk påvirkning, som involverede regulering af vigtige signalveje i in§amation, argininbiosyntese samt pantothenat- og CoA-biosyntese, der korrelerede med mitokondrierfunktion. ACT-behandling reducerede mikroglia M1-polarisering ved at hæmme NF-KB-signalvejen. Og de metaboliske veje blev yderligere bekræftet af HPLC-Q-TOF-MS. Derudover korrigerede ACT overdreven ROS for at genoprette mitokondrierfunktionen gennem AMPK-medieret PGC-1 og UCP-2 opregulering, i overensstemmelse med metaboliske ændringer. Spændende nok kan ACT binde direkte til både NF-KB og AMPK, som det fremgår af molekylær docking. Konklusioner: Forskningen gav en infusiv mekanisme for ACT og illustrerede et nyt perspektiv baseret på mitokondriel dysfunktion for at afsløre forbindelsen mellem metabolisme og mikroglia polarisering.

Baggrund

Alzheimers sygdom (AD) er en almindelig neurodegenerativ sygdom ledsaget af kognitiv svækkelse og dyskinesi[1]. Det er kendetegnet ved alvorligt neuronalt tab, senile plaques og neuro|brillære sammenfiltringer[2]. Patogenesen af ​​AD er multidimensionel og forbundet med neuroin§amation. Neuroin§amation er drevet af aktivering af gliaceller, tæt forbundet med udviklingen af ​​AD[3, 4]. Under progressionen og forværringen af ​​neuroin§amation betragtes mikroglia som nøglefaktoren. Microglia er de primære immunceller i centralnervesystemet. Det er tæt forbundet med en kaskade af processer, der indeholder hjerneudvikling, opretholdelse af et neutralt miljø, samt reagere på skader og reparation[1]. Desuden kan mikroglia stimuleres til en M1-fænotype, og ekspressionen af ​​pro-in§ammatoriske cytokiner øges, når neuroin§amationsrelaterede sygdomme som AD opstod[5]. Undersøgelser viser også, at polariseringen til M1-fænotypen ofte er ledsaget af metaboliske forstyrrelser[6], hvilket forårsager ubalance i energimetabolismen og mitokondriel dysfunktion[7]. Disse negative ændringer er afledt af neurodegeneration, selv AD.

Acteosid(ACT), et phenylethanoid glycosid, er primært afledt afCistanchetubulosa. Det har flere beviser antydetHANDLINGbesad talrige farmakologiskeaktiviteter, herunder neurobeskyttende[8], anti-in§ammatoriske[9] og antioxidant[10] virkninger. Det er især blevet rapporteret, at ACT forbedrer indlærings- og hukommelsessvækkelse samt opregulerer energimetabolismen hos streptozotocin-inducerede rotter[11]. Det er også blevet foreslået at hæmme neuronal apoptotisk celledød og mitokondriel skade i de eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis-mus [12]. Men færre undersøgelser har været fokuseret på effekten af ​​ACT på mikroglia M1/M2 polarisering. Især forskellige mekanismer, såsom reparation af mitokondrierfunktion og regulering af cellemetabolisme, er ikke blevet udført. Hertil kommer mekanismen afHANDLINGbidraget til mikroglia M1/M2 polarisering er forblevet uudforsket. Denne rapport havde til formål at undersøge den terapeutiske effekt af ACT samt den underliggende molekylære mekanisme afHANDLINGiAD. Heri,HANDLINGviste en signifikant neurobeskyttelseseffekt i AlCl3-inducerede AD-zebrafisklarver. Derudover hæmmede ACT effektivt M1-polarisering og fremmede M2-fænotypen i LPS-inducerede BV-2-celler. RNA-Sequencing (RNA-Seq) integreret med metabolomics-metoden for bedre at forstå den underliggende mekanisme af ACT til at regulere mikroglia-polarisering. Krydstalen mellem metabolisme og mikroglia-polarisering med hensyn til mitokondriel funktion blev undersøgt. Denne undersøgelse vil give ny respekt for den videre undersøgelse af ACT som et potentielt terapeutisk middel til behandling af AD.

Metoder

Dyr og modelgruppering

Vildtype zebra¦sh (AB-stamme, 4 måneder gammel) blev valgt i denne undersøgelse (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). De blev holdt under en 14/10 time lys/mørke-cyklus ved 28 grader, efter den tidligere metode[13]. Naturlig gødning og normalt udviklede embryoner blev genereret og dyrket til 3 dage efter befrugtning (pdf) i en belysningsinkubator. Alle zebrafiskeksperimenter blev udført under tilsyn af Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University. Zebrafisklarver blev opdelt i seks grupper og behandlet fra 3 pdf til 7 pdf: kontrolgruppe, modelgruppe, model plus donepezil hydrochlorid (DPZ) gruppe, model plus ACT grupper. Kontrolgruppen blev holdt i mediet med 0,2 procent DMSO, og modelgruppen blev behandlet med 150 μM AlCl3 (pH 5,8). Modellen plus DPZ-gruppen blev co-behandlet med AlCl3 og 8 μM DPZ. Modellen plus ACT-grupper blev samtidig behandlet med AlCl3 og forskellige koncentrationer af ACT (200, 100, 50 μM). ACT (HPLC renhed større end eller lig med 98 procent) blev opnået fra Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kina). AlCl3·6H2O og DPZ blev købt fra Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Kina).

Adfærdsanalyse Side 3/34 Zebrafisklarvernes bevægelser blev registreret med en ViewPoint adfærdsanalysator (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ved 28 grader. Kort sagt, adfærdsparametrene og resultatbehandlingen var i overensstemmelse med den metode, vi etablerede tidligere[13]. Her blev gennemsnitshastighed (AS), hastighedsændring (ΔS), dyskinesi recovery rate (DRR) og responseffektivitet (RE, procent) udvalgt til at evaluere dyskinesi recovery hos zebrafisk.

Bestemmelse af acetylcholinesterase (AChE) og cholin acetyltransferase (ChAT) aktivitet

Efter behandling fra 3 pdf til 7 pdf blev zebrafisklarver opsamlet for at måle AChE og ChAT aktivitet.

Baseret på producentens protokol blev aktiviteten detekteret ved hjælp af enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina). Og proteinkoncentrationerne af forskellige prøver blev bestemt ved BCA-metoden

Cellekulturer og behandlinger

BV-2-cellelinje (udødeliggjort murin mikroglialcellelinje) blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). De blev dyrket i DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kina). Mediet blev suppleret med 10 procent FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/ml penicillin samt 100 mg/ml streptomycin med 95 procent luft/5 procent CO2 ved 37 grader. BV-2-celler blev inkuberet med ACT (50, 25, 12,5 μM) eller stimuleret med Lipopolysaccharid (LPS, 1 ug/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 24 timer. Til sidst blev alle cellerne eller supernatanten opsamlet til de forskellige analyser.

Cellelevedygtighedsanalyse

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-assay (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina) blev brugt til at evaluere levedygtigheden af ​​BV-2-celler. Cellerne blev podet i en 96-brøndplade (1 x 104 celler/brønd, Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.). Kort fortalt blev mediet fjernet ved afslutningen af ​​behandlingen, og 100 μL serumfrit medium indeholdende CCK-8-opløsning blev tilsat til hver brønd i 2 timer ved 37 grader. Absorbansen blev målt ved 450 nm med en mikropladelæser (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA). Cellelevedygtighed er udtrykt som en procentdel af kontrolgruppen. Forsøget blev gentaget tre gange.

Nitrogenoxid (NO) produktionsassay

NO blev bestemt ved at måle nitritniveauer i BV-2 kultursupernatanten under anvendelse af Griess-reagens. Kort sagt, ved afslutningen af ​​behandlingen blev mediet (100 μL) overført til en ny 96-brøndplade. Det samme volumen Griess-reagens blev tilsat til hver brønd og reageret i 15 minutter i mørke. Absorptionen ved 540 nm blev bestemt med en mikropladelæser.

Niveauer af inflammatoriske cytokiner i supernatanten

Koncentrationerne af TNF-, IL-1 og IL-10 i BV-2-cellesupernatant blev bestemt ved hjælp af ELISA-kits i henhold til producentens instruktioner (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kina ).

Observation af cellulær morfologi

For at bestemme effekten af ​​ACT på BV-2-cellens M1/M2-polarisation blev cellerne udpladet i en 6-brøndskål og observeret under det omvendte mikroskop (Nikon ECLIPSE Ti2, Japan).

Cellulær metabolismebestemmelse ved HPLC-Q-TOF-MS-analyse

BV{{0}}-celler blev podet i en 6-brøndskål separat (n=6/gruppe). Efter behandling blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket tre gange med kold PBS. Derefter straks udsat for flydende nitrogen for at undertrykke cellernes stofskifte. Cellerne blev høstet med kold 80 procent methanol (1 ml/brønd), og suspensionen blev overført til et 2 ml Eppendorf-rør. For at lette proteinudfældning, vortexes kraftigt i 1 minut og centrifugeres ved 13,000 rpm i 15 minutter ved 4 grader. Cellesuspensionen blev overført til et nyt 2 mL Eppendorf-rør og tørret under en strøm af nitrogen og opbevaret ved -80 grad indtil analyse. Den tørrede rest blev rekonstitueret i 15 {{40}} μL forafkølet 25 procent acetonitril. For at sikre stabiliteten og nøjagtigheden af ​​sekvensanalysen blev lige store volumener (10 μL) af hver celleprøve kombineret som kvalitetskontrolprøver (QC). Under metabolitdetektion blev disse prøver injiceret efter hver sjette celleprøve for at bekræfte deres stabilitet. En 1 μL aliquot blev injiceret til HPLC-Q-TOF-MS. HPLC-Q-TOF-MS-analyse blev udført på Agilent 1290 HPLC-system forbundet med Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Adskillelsen blev udført på en ACQUITY UPLC BEH C18 kolonne (2,1×100 mm, 1,7 μm). Den mobile fase var sammensat af 0,1 procent myresyre-vand (v/v; A) og acetonitril (B). §ow-hastigheden blev sat til 0,4 ml/min med følgende optimale gradientelueringsbetingelser: 0 til 2 minutter, 5 procent B; 2 til 20 minutter, 5 procent til 95 procent B (positiv ion-tilstand); 0 til 2 minutter, 5 procent B; 2 til 20 minutter, 5 procent til 95 procent B (negativ ion-tilstand). Driftsparametrene for massespektrometeret blev indstillet som følger: gastemperatur, 320 grader; tørregas, 10 l/min; forstøver, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V. De rå data blev betjent under MassHunter Workstation Software version B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). De rå data blev forbehandlet af XCMS-platformen. Principalkomponentanalyse (PCA) og partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) af de normaliserede data blev udført med MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Kombineret med litteratur blev de differentielle metabolitter (VIP > 1, T-test P < 0,05)="" identificeret="" på="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" til="" sidst="" blev="" pathway-analyse="" udført="" med="">

Måling af mitokondrielt membranpotentiale (MMP)

MMP blev detekteret ved hjælp af §uorescerende sonde JC-1 (Beyotime, Kina) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler fra forskellige grupper skyllet med PBS og inkuberet med JC-1-farvningsopløsning i 20 minutter ved 37 grader. Efter farvning blev celler vasket to gange under anvendelse af farvningsbuffer. Derefter blev fluorescerende signaler detekteret ved flowcytometri (BD Accuri C6).

Måling af mitokondrie adenosin 5'-triphosphat (ATP)

ATP-koncentration i mitokondrier blev detekteret af et ATP-assaykit (Beyotime, Kina) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Kort fortalt blev dyrkningsmediet af BV-2-celler fra forskellige grupper kasseret, og cellerne blev homogeniseret med lyseringsbuffer på is. Supernatanten opnået efter centrifugering (12, 000 g, 5 min) blev anvendt til at bestemme ATP-koncentrationen. Luminescensen (luciferase-katalyseret §uorescein-reaktion) blev detekteret af EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Måling af intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) niveau

ROS Assay Kit (Beyotime, Kina) blev brugt til at måle ROS-niveau. Cellerne fra forskellige grupper blev inkuberet med DCFH-DA (10 μM) i 20 minutter ved 37 grader. Efter probeladning blev cellerne vasket tre gange med DMEM. Derefter blev §uorescerende signaler detekteret ved flowcytometri (BD Accuri C6)

Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

BV-2-celler blev podet i en 6-brøndskål. Mediet blev fjernet, og 1 ml 2,5 procent glutaraldehyd blev hurtigt tilsat til hver brønd. Derefter blev cellerne overført til et 1,5 ml Eppendorf-rør og centrifugeret ved 1000 rpm i 3 minutter. Cellerne blev fikseret natten over med ny 2,5 procent glutaraldehyd ved 4 grader. Efter ¦xation, dehydrering og indlejring blev cellerne observeret med et HT7800 transmissionselektronmikroskop (Hitachi, Tokyo, Japan).

RNA-seq og bioinformatisk dataanalyse

Total RNA fra BV-2 celler (n=3/gruppe) blev ekstraheret ved hjælp af Trizol-reagens (Vazyme Biotech, Kina) i henhold til reagensproducentens instruktioner. Alle analytiske prøver blev sendt til Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) for at udføre RNA-sekvensanalysen. Dataene blev analyseret på Majorbio Cloud Platforms gratis online platform. Parametrene for den differentielle ekspressionsanalyse varP-adjust < 0.05 og |log2FC|Større end eller lig med1. De originale sekvensdata er blevet indsendt til databasen for NCBI Sequence Read Archive (SRA).

Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qRT-PCR)

Det totale RNA af BV-2-celler i hver gruppe blev høstet ved hjælp af et 500 μL RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Kina), og en omvendt transkriptionsreaktion blev udført med FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Kina) . Reaktioner blev udført i overensstemmelse med producentens protokol. cDNA blev udsat for qRT-PCR-assays med specifikke primere og TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Kina). Primerne er opført i tabel S1 (se yderligere fil 1), og -actin blev brugt som den interne kontrol. 2-ΔΔCT-metoden blev brugt til kvantitativ analyse.

Western blot analyse

BV-2-celler blev lyseret af RIPA-lysebuffer (KeyGen Biotech Co., Ltd, Nanjing, Kina) indeholdende 1 procent proteasehæmmercocktail (Thermo Fisher) for at opnå totalt protein. En 10 procent SDS-PAGE blev udført for at adskille proteinerne, som blev overført til NC-membraner. Efter blokering med 5 procent skummetmælk/BSA i 2 timer, blev membranerne inkuberet med AMPK (Proteintech), p-AMPK (A¨nity Biosciences), PGC-1 (Proteintech), NF-κB (Proteintech), p-NF-κB (ABclonal) eller GAPDH (ABclonal) antistoffer i 5 procent TBST ved 4 grader natten over. Membranerne blev inkuberet med et sekundært peberrodsperoxidase-konjugeret antistof (ABclonal) i 1 time ved stuetemperatur. High-sig ECL western blotting-substratet (Tanon, Kina), Gel-billeddannelsessystem (Tanon, Kina) og ImageJ-software blev brugt til visualisering og kvantificering.

Molekylær docking

Molekylær docking-analyser blev udført ved hjælp af Autodock-software (version 4.2). Affiniteten mellem ACT og proteiner blev observeret af AutodockTools software. De tredimensionelle (3D) proteinstrukturer af AMPK (PDB ID: 5g5j) og NF-KB (PDB ID: 4q3j) blev hentet fra Protein Data Bank

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Forskellene mellem de forskellige grupper blev analyseret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Tukeys multiplum.

Resultater

ACT lindrede dyskinesi og forbedrede cholinerge systemfunktion i zebrafisklarver

AlCl3-induceret AD-model i zebrafisklarver blev brugt til at demonstrere effekten af ​​ACT på AD. For det første blev zebrafisklarvernes bevægelse inden for lys/mørke cyklusser observeret, og deres svømmestier blev registreret (fig. 1a, 1b). AS og ΔS af zebrafiskbevægelse induceret af AlCl3 i den tilsvarende tid efter administration blev beregnet. Resultaterne viste, at forskellige doser af ACT effektivt øgede AS og ΔS af zebrafisk (fig. 1c). DRR og RE afslørede en mere intuitiv sammenligning af ACT og DPZ (fig. 1d). Følgelig lindrede ACT dyskinesi og udviste lignende virkninger som DPZ. Der er generelt enighed om, at det kolinerge system spiller en vigtig rolle i indlærings- og hukommelsesprocesser. Således blev aktiviteterne af AChE og ChAT brugt til at afsløre effekten af ​​ACT. AlCl3 eksponering i zebrafisk gengivet med hjernens kolinerg ændring (fig. 1e). Det var enestående, at ACT-behandling undertrykte aktiviteten af ​​AChE. Derudover udviste aktiviteten af ​​ChAT et fald efter ACT-behandling. Kort fortalt viste ACT en dyb indvirkning på det kolinerge systemfunktion i AlCl3-inducerede AD zebrafisklarver.

ACT undertrykte M1-polarisering og fremmede M2-polarisering i LPS-inducerede BV-2-celler

Virkningerne af ACT på mikroglia-polarisering blev undersøgtin vitroved hjælp af BV-2 mikrogliaceller. LPS nedsatte BV-2-cellers levedygtighed signifikant efter at være blevet behandlet i 24 timer. Heldigvis øgede ACT cellelevedygtigheden af ​​LPS-inducerede BV-2-celler (fig. 2a). Derudover blev morfologien af ​​BV-2-celler observeret. Efter 24 timers LPS-stimulering viste det, at BV-2-celler undergik en M1-polarisationstilstand. Og de morfologiske ændringer blev forhindret ved ACT-sambehandling (fig. 2b). Desuden viste resultaterne, at i modsætning til BV-2-celler stimuleret af LPS, viste BV-2-celler behandlet med ACT signifikant undertrykt TNF- (fig. 2c), IL-1 ( Fig. 2d) og NO (Fig. 2f) udtryk i cellesupernatant. Disse er klassiske pro-in§ammatoriske cytokiner som indikatorer for M1 mikroglia polarisering. I lighed med resultaterne af ELISA opdagede resultaterne af qPCR, at TNF-, nitrogenoxidsyntase (iNOS), IL-1 og CD86 mRNA-udtryk var signifikantekan hæmmes af ACT-behandling sammenlignet med LPS-gruppen (fig. 3a). Desuden målte vi M2 mikroglia polarisationsniveauer ved ELISA (fig. 2e) og qPCR (fig. 3b), hvis resultater indikerede, at ACT signifikant øgede M2 ​​mikroglia-relaterede markørekspressionsniveauer (IL-10, CD206 , TGF- og Arg-1). Tilsammen viste disse resultater, at ACT undertrykte M1 mikroglia-polarisering og fremmede M2-fænotypen.

ACT regulerede M1/M2-polarisering via inhibering af NF-KB-signalvejen i LPS-inducerede BV-2-celler

Den transkriptomiske analyse blev udført af RNA-seq for at forstå mekanismen af ​​ACT i BV-2-celler fra et overordnet niveau. PCA illustrerede, at kontrol-, LPS- og ACT-grupperne godt kunne skelnes (fig. 4a). Det afslørede 899 differentielt udtrykte gener (DEG'er) mellem kontrolgruppen og LPS-gruppen, hvorimod 49 DEG'er var mellem LPS-gruppen og ACT-gruppen (fig. 4b). Konsekvent afslørede Gene Ontology (GO) berigelsesanalyse (fig. 4c) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) berigelsesanalyse (fig. 4d), at effekten af ​​ACT var involveret i NF-KB-signalvejen. Sættet af gener forbundet med NF-KB-signalvejen blev yderligere bekræftet, og deres homeostase var bestemt påvirket af LPS. Som forventet påvirkede ACT deres udtryk betydeligt (fig. 4e). En NF-KB-signalvej er en klassisk vej til at regulere progressionen af ​​in§amation, hvilket i sidste ende resulterer i frigivelse af pro-in§ammatoriske faktorer. For at opnå mekanistisk støtte blev et nøgleprotein fra NF-KB-signalvejen evalueret ved western blot-analyse. LPS-stimulering førte til aktivering af NF-KB, forbundet med at fremme M1-polarisering. I overensstemmelse med RNA-seq-analyse hæmmede ACT LPS-stimuleret NF-KB-phosphorylering (fig. 4f). Derfor lettede ACT den LPS-inducerede M1-polarisering via NF-KB-signalvejen i BV-2-celler.

ACT svækkede argininbiosyntese samt pantothenat- og CoA-biosyntese i LPS-inducerede BV-2-celler

RNA-seq viste, at de veje, der påvirkes af ACT, også omfattede arginin (Arg) biosyntese såvel som pantothenat og CoA biosyntese (fig. 4d). Og det er blevet foreslået, at LPS-stimulering forårsager BV-2-cellers metabolismeforstyrrelser forbundet med M1-polarisering[14]. Således blev et ikke-målrettet cellemetabolom af HPLC-Q-TOF-MS brugt til at identificere effekten af ​​ACT på cellemetabolisme. PCA (fig. 5a) og PLS-DA (fig. 5b) illustrerede, at kontrol-, LPS- og ACT-grupperne godt kunne skelnes baseret på intracellulære metabolitter. Niveauerne af forskellige metabolitter i LPS-inducerede BV-2-celler blev ændret efter ACT-behandling (fig. 5c). Sammenlignet med kontrolgruppen var der 11 metabolitter ændret signifikant i LPS-gruppen (tabel S2, se yderligere ¦le 2). Mens 14 metabolitter blev tydeligt ændret efter behandlingen af ​​ACT (tabel S3, se yderligere afsnit 3), der involverede 11 metaboliske veje (fig. 5d). Virkningen af ​​ACT bestod hovedsageligt af regulering af aminosyremetabolisme (phenylalanin, tyrosin og tryptophan biosyntese, D-glutamin og D-glutamat metabolisme, Arg biosyntese, phenylalanin metabolisme), nukleotid metabolisme (purin metabolisme, pyrimidin metabolisme), energi metabolisme (nitrogen metabolisme). metabolisme), samt metabolismen af ​​cofaktorer og vitaminer (pantothenat og CoA biosyntese). Interessant nok var de metaboliske veje opnået af metabolom i overensstemmelse med RNA-seq, inklusive Arg-biosyntese såvel som pantothenat- og CoA-biosyntese. Ovenstående viste, at ACT kunne regulere Arg-biosyntese såvel som pantothenat- og CoA-biosyntese i LPS-stimulerede BV-2-celler.

Act Mitigated Lps-induced Bv-2 Mitokondriel dysfunktion

Mitokondrier er kernen i metaboliske veje. Beviser udvikler sig på, at mitokondrier er nøglespillere i mikroglial M1/M2-polarisering. Tidligere forskning viste, at LPS kunne forårsage mitokondriel dysfunktion. En oversigt over mitokondrierstatus i morfologi og cellefordeling blev bedømt ved TEM. Efter LPS-stimulering viste BV-2-celler kernekromatinkondensation, nedsat cytoplasma samt færre mitokondrier (fig. 6a). Derudover blev de mitokondrielle cristae i LPS-gruppen uarrangerede eller endda forsvundet, hvilket udviste delvis kristolyse, reduceret størrelse og rundformet morfologi. Interessant nok kunne ACT-behandling lindre LPS-inducerede morfologiske ændringer i mitokondrier. På skift undersøgte vi mitokondriefunktionen af ​​LPS-behandlede BV-2-celler, inklusive MMP, og mitokondriel ATP-produktion. MMP (fig. 6b, 6c) og ATP-produktionen i mitokondrier (fig. 6d) var signifikant forbedret i celler behandlet med ACT sammenlignet med dem i LPS-gruppen. Mitokondriel dysfunktion kan være relateret til det øgede niveau af ROS i cellen. Flowcytometrianalyse afslørede, at indholdet af ROS var overbelastet i LPS-gruppen (fig. 6e, 6f). Heldigvis eliminerede ACT overdreven ROS. Det tyder på, at ACT kan genoprette mitokondrierfunktionen ved at rydde ROS.

ACT genoprettede mitokondrierfunktionen gennem opregulering af PGC-1 og UCP-2

Peroxisom proliferativ aktiveret receptor-co-aktivator-1 (PGC-1) spiller en vigtig rolle i mitokondriel biogenese[15]. Stimuleringen af ​​LPS reducerede ekspressionen af ​​PGC-1, hvilket udviste mitokondrier dysfunktion. Bemærkelsesværdigt blev PGC-1-gen-mRNA og proteinekspression signifikant reverseret ved ACT-behandling i LPS-behandlede BV-2-celler (fig. 7a). Det mitokondrielle afkoblingsprotein-2 (UCP-2) var også kendt for at regulere mitokondrielle funktioner. Som et nedstrøms protein af PGC-1 kan det kontrollere LPS-induceret MMP-depolarisering og ROS-produktion. Nylige rapporter indikerer, at det er centralt for processen med mikroglial aktivering, med modsat regulering af M1 og M2 polarisering[16]. Western blot-resultater viste, at UCP-2-proteinniveauet var faldet efter LPS-stimulering. Samtidig behandling af LPS og ACT kunne opregulere ekspressionen af ​​UCP-2 sammenlignet med LPS-behandlingen. mRNA-ekspressionsniveauet for UCP-2 viste også lignende ændringer (fig. 7b). Tilsammen genoprettede ACT mitokondriernes funktion gennem opregulering af PGC-1 og UCP-2.

ACT undertrykte mikroglia M1-polarisering gennem gendannelse af mitokondriel funktion via AMPK-aktivering

AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK), som den centrale cellulære energisensor, spiller en vigtig rolle i at opretholde cellemetabolismebalancen. Samtidig er PGC-1 et nedstrømsprotein af AMPK. Resultater afslørede, at LPS hæmmede aktiveringen af ​​AMPK, hvilket resulterede i cellemetabolismeforstyrrelser og mitokondriel dysfunktion. Det er bemærkelsesværdigt, at ACT dosisafhængigt kunne øge proteinekspressionen af ​​p-AMPK (fig. 8a). Det foreslås, at ACT kan øge ekspressionen af ​​PGC-1 og genoprette mitokondriefunktionen ved at aktivere AMPK-signalvejen. I denne undersøgelse, for at undersøge, om aktiveringen af ​​AMPK bidrog til ACT-reguleringseffekten på M1/M2-polarisering, blev forbindelse C (CC) anvendt til at hæmme virkningen af ​​AMPK. I modsætning til det nedregulerede NO-niveau i ACT-behandlingsgruppen blokerede CC delvist virkningen af ​​ACT på NO-niveauet (fig. 8d). Baseret på disse resultater kunne ACT regulere M1/M2-polarisering af BV-2-celler ved aktivering af AMPK.

ACT-binding til og hæmmede NF-KB samt aktiveret AMPK

Molekylær docking blev anvendt for at bekræfte, om ACT binder til NF-KB- og AMPK-proteinerne. Fund viste, at bindingsenergien af ​​ACT og NF-κB var -8,4 kcal/mol, hvilken af ​​ACT og AMPK var -10,8 kcal/mol. Betydelige enheder bekræftede, at ACT er direkte bundet til NF-KB og AMPK (fig. 9). Efterfølgende blev de mulige bindingsmåder og interaktioner i aminosyrelommen yderligere undersøgt, herunder Phe A146, Pro A147, Asn A240, Leu A236, Arg A232, His A183, Arg A239, Glu A179, Cys A149 og Tyr A227 af NF -KB (fig. 9c) såvel som Phe A213, Gly A481, Ala A370, Leu A482, Arg A212, Ile A369, Arg A106, Phe A215, Phe A108, Thr A309, Ser A119 og Thr A2Fig4 9f). Disse resultater indikerede, at ACT direkte kunne påvirke NF-KB og AMPK for at dæmpe BV-2 mikroglia M1-polarisering og fremme M2-fænotypen.