Acteosid som en potentiel terapeutisk mulighed for primært hepatocellulært karcinom: en præklinisk undersøgelse

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Di Ma, Juan Wang, Lu Liu, Meiqi Chen og Zhiyong Wang

Abstrakt

Baggrund: Hepatocellulært karcinom (HCC) er en almindelig malign tumor med karakteristika af dårlig prognose, høj morbiditet og dødelighed på verdensplan. Især er der kun få systemiske behandlingsmuligheder tilgængelige for avancerede HCC-patienter og inkluderer sorafenib og det nyligt beskrevne atezolizumab plus bevacizumab-regime som mulige førstelinjebehandlinger. Vi foreslår her acteosid, et phenylethanoid-glycosid, der er udbredt i mange lægeplanter, som en potentiel kandidat mod fremskreden HCC.

Metoder: Celleproliferation, kolonidannelse og migration blev analyseret i de tre humane HCC-cellelinjer BEL7404, HLF og JHH-7. Angiogeneseassay blev udført under anvendelse af HUVES'er. BEL7404 eller JHH-7 xenograft nøgne mus-modellen blev etableret for at analysere de mulige antitumorvirkninger af acteosid. qRT-PCR og western blotting blev brugt til at afsløre de potentielle antitumormekanismer af acteosid.

Resultater:Acteosid fra cistanchehæmmede celleproliferation, kolonidannelse og migration i alle de tre humane HCC-cellelinjer BEL7404, HLF og JHH-7. Akteosids forbud mod angiogenese blev afsløret ved hæmningen af ​​rørdannelse og cellemigration af HUVEC'er. Kombinationen af ​​acteosid og sorafenib gav stærkere hæmning af cellekolonidannelse og migration af HCC-cellerne såvel som angiogenese af HUVEC'er. In vivo antitumoreffektiviteten af ​​acteosid blev yderligere demonstreret i BEL7404- eller JHH-7-xenograft-nøgne mus-modellen med en forbedring, når det kombineres med sorafenib, til at hæmme væksten af ​​JHH-7-xenograft. Yderligere behandling af JHH-7-celler med acteosid afslørede en stigning i niveauet af tumorsuppressorprotein p53 såvel som et fald i kallikrein-relateret peptidase (KLK1, 2, 4, 9 og 10) genniveau uden signifikant ændringer af resten af ​​KLK1-15 gener.

Konklusioner:Acteosid fra cistancheudøver en antitumoreffekt muligvis gennem dets opregulering af p53-niveauer samt hæmning af KLK-ekspression og angiogenese. Acteosid kunne være nyttigt som et supplement til behandling af fremskreden HCC i klinikken.

Nøgleord: Acteosid, Hepatocellulært karcinom, Sorafenib, Xenograft, p53, Kallikrein

Baggrund

Hepatocellulært karcinom (HCC) er en almindelig malign tumor med karakteristika af dårlig prognose og høj morbiditet og dødelighed på verdensplan [1, 2]. Forskellige faktorer er blevet identificeret for at bidrage til forekomsten og progressionen af ​​HCC, herunder infektion med hepatitis B- eller C-virus, inaktivering af tumorsuppressorgener såsom p53, den unormale aktivering af onkogener såsom K-ras og nogle signalmolekyler såsom PI3K, ERK/MAPK og Wnt/-catenin samt undvigelse af værtens immunsystem [3, 4]. Til behandling af HCC er resektion, levertransplantation og radiofrekvensablation muligheder for HCC-patienter i tidlige stadier, men med høje forekomster af tilbagefald og metastaser [3, 5, 6]. Derudover er der kun få systemiske behandlingsmuligheder tilgængelige for avancerede HCC-patienter og omfatter sorafenib og det nyligt beskrevne atezolizumab plus bevacizumab-regime som mulige førstelinjebehandlinger [7]. I denne sammenhæng er det af betydning og interesse enten at udvikle nye midler rettet mod flere molekylære mål eller opstille en ny strategi såsom anvendelse af kombineret terapi i behandlingen af ​​fremskreden HCC.

Acteosid fra cistancheer et phenylethanoid glycosid, der er udbredt i mange lægeplanter, herunder Ligustrum purpurascens [8], Rehmannia glutinosa [9] og Ligustrum purpurascens [10]. Flere beviser har vist, at acteosid kan udøve forskellige biologiske aktiviteter, herunder dets antitumoraktivitet. For eksempel viste acteosid stærke antiproliferative effekter på prostatacancerceller [11]. Intraperitoneal levering af acteosid undertrykte tumorvækst i en melanom musemodel muligvis gennem inhibering af proteinkinase C [12]. Derudover forstærkede acteosid sensibiliseringen af ​​kolorektale cancerceller over for 5- Fluorouracil via målrettet PI3K/Akt-signalering [13]. Vores tidligere data har også vist hæmning af melanogenese af acteosid i B16 melanomceller [14]. På trods af dette er der kun få oplysninger om den mulige effekt af acteosid i behandlingen af ​​HCC og de potentielle underliggende mekanismer.

Det har vi vist i nærværende undersøgelseActeosid fra cistanchehæmmer celleproliferation, kolonidannelse og migration i alle tre humane HCC-cellelinjer BEL7404, HLF og JHH7. Angiogenesen hæmmes også efter behandling med acteosid, som vist ved hæmningen af ​​rørdannelse og cellemigration af HUVEC'er. Acteosids antitumoreffektivitet in vivo er yderligere demonstreret i BEL7404- eller JHH-7-xenograft-nøgne mus-modellen med en forbedring, når det kombineres med sorafenib, til at hæmme væksten af ​​JHH-7-xenograft. Antitumorvirkningerne af acteosid kunne tilskrives dets opregulering af p53 såvel som undertrykkelse af KLK'er og angiogenese.

Metoder

Cellekultur

De humane hepatocellulære carcinom (HCC) cellelinjer BEL7404, HLF og JHH7 blev opnået fra American Type Culture Collection og blev rutinemæssigt dyrket i DMEM-medium indeholdende 10 procent føtalt bovint serum suppleret med 100 enheder/ml penicillin G og 100 ug/ml streptomycin i en fugtig inkubator ved 37 grader med 5 procent kuldioxid. Humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) blev isoleret fra de humane navlestrengsvener (leveret af ScienCell Research Laboratories, San Diego, USA) og holdt i et endotelcellemedium som beskrevet tidligere [15].

ReagenserActeosid fra cistanche (A01) blev købt fra Jiangsu Yongjian Medicine Technology Co., Ltd. (Taizhou, Kina; parti nr. 100581; renhed større end eller lig med 99 procent af HPLC). Sorafenib blev opnået fra Selleck Chemicals (Houston, USA). Vi opløste acteosid i 0,9 procent saltvand. Stamopløsningen af ​​sorafenib blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO; 10 mM), uddelt i portioner og opbevaret ved -20 grader.

Dyr

BALB/c (Nu/Nu) hanmus (18-20 g, 6-8 uger på modtagelsestidspunktet) blev brugt i undersøgelsen (Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd., Shanghai, Kina). Dyr er blevet anbragt i individuelt ventilerede polysulfonbure i et temperatur- og lyskontrolleret rum (12 timers lys- 12 timers mørkecyklus, lys tændt kl. 7:00 om morgenen) med fri adgang til mad og vand . Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee og udført i henhold til retningslinjerne fra International Association for the Study of Pain vedrørende brugen af ​​forsøgsdyr.

Celleproliferationsassay Den anti-proliferative aktivitet blev udført under anvendelse af MTT assay. Kort fortalt blev celler udpladet med en tæthed på 4-5 × 103 celler pr. brønd i 96-brøndsplader. Efter at være blevet fæstnet natten over blev celler behandlet med en række koncentrationer af acteosid. Efter lægemiddelbehandlingerne på det angivne tidspunkt blev celler inkuberet med 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN, USA. Slutkoncentration: 5 ug/ml) i 3-4 timer ved 37 grader. Formazanproduktet blev opløst i DMSO til kvantificering ved en bølgelængde på 570 nm.

Colony formation assay Cells were seeded in 24-well plates at a density of 200 cells per well and allowed to attach to the bottom of the well overnight. Cells were then treated with indicated drugs at the given concentration. The culture medium was replaced every 3 days until colonies were visible on day 12 post-culturing. For colonies counting, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with 0.1% crystal violet. Colonies>10 celler blev talt under et lysmikroskop (× 100 forstørrelse; Olympus, Tokyo, Japan).

Sårhelingsassay Cellerne blev podet i {{0}}brøndsplader (1 × 105 celler pr. brønd) og dyrket til 90 procent konfluens. Cellelaget blev ridset med en steril 200 ul pipettespids for at frembringe et sårgab. Cellemigration ind i det sårede område blev visualiseret på angivne tidspunkter (0, 10 og 24 timer) under et inverteret lysmikroskop ved en forstørrelse på × 100. Hvert eksperiment blev udført i tre eksemplarer.

Rørdannelsesassay HUVEC'erne blev dyrket som tidligere beskrevet [15]. Kort fortalt blev 96-brøndpladerne coatet med Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) i henhold til producentens instruktioner og derefter returneret til inkubatoren for at polymerisere i 30-40 min. HUVEC'erne blev derefter podet ved en tæthed på 2 × 105 celler/ml og behandlet med forskellige givne lægemidler i 8 timer. Rørdannelse blev fotograferet med et omvendt mikroskop på de angivne tidspunkter og analyseret ved hjælp af ImageJ-software.

Western blotting analyse

Totale cellelysater blev fremstillet med radioimmunpræcipitationsassaybuffer (RIPA) (50 mM Tris HCl ved pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 procent NP40, 1 procent natriumdeoxycholat, 0,1 procent SDS, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml aprotinin og 2 mM PMSF). Proteinprøver med lige store mængder (20 ug/bane) blev separeret på SDS-PAGE-gel og overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranerne blev inkuberet natten over med p53-antistof (Cell Signaling Technology, Boston, MA). Til påfyldningskontroller blev membranerne skyllet med en strippingbuffer og genproberet med -actin-antistoffet (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Proteiner blev påvist ved hjælp af et ECL-detektionssystem (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA).

QRT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra cellelinjer under anvendelse af Trizol-reagenset (Invitrogen, USA) og gennemgik en revers transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) for at syntetisere cDNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit. Real-time qRT-PCR ved hjælp af 2xSYBR grøn qPCR Supermix blev udført på Stratagene Mx3000P PRC maskinen (Agilent Technologies, USA). Primersekvenserne blev vist nedenfor: sense 5'-CACCATGTGG TTCCTGGTTC-3' og anti-sense 5'-CAAACAAGTT GTGGCGACCC-3' for KLK1; sense 5'-GTGTACAGTC ATGGATGGGC-3′ og anti-sense 5'-CCCAGAATCA CCCCCACAAG-3′ for KLK2; sense 5'- CCACACCC GCTCTACGATATGA-3' og anti-sense 5'-CCC AGA ATCACCCGAGCAG-3' for KLK3; sense 5'-CGCACA CTGTTTCCAGAACTC-3' og anti-sense 5'- GTTG CAGGAGTCCTTCTGGT-3' for KLK4; sense 5'-CCTG CACCCACATCTTTCTCT-3′ og anti-sense 5'- GGTAAGCATCCTCGCACCTT-3' for KLK5; sense 5'- CTCTCTCCTGGGGACACAGA-3′ og antisense 5'-TCCGCCATGCACCAACTTAT-3' for KLK6; sense 5′- TTTTGGAGCCCAGCTGTGTG-3′ og anti-sense 5′- GTCACCATTGCAGGCGTTTT-3′ for KLK7; sense 5′- CTGGGCAGGACACTCCAG-3′ og antisense 5′- ACACCGCCACAGAGTAGTTG-3′ for KLK8; sense 5′- GTAGGGGGTTCTCGTAGGGT-3′ og anti-sense 5′- CGGTGACGTCATAGAGACGG-3′ for KLK9; sense 5'-CAGGAGTGCCAGCCTCAC-3′ og anti-sense 5'- CTGGGGAGGAAGAGGATGGA-3' for KLK10; sense 5'-CCCACCCCTTGGATTCTGTCT-3' og anti-sense 5'-GTGAACTATGTAGCGGGGCT-3' for KLK11; sense 5'-TGTTCTTGGTGAGTTCTCCCG-3′ og antisense 5'-GGATCCAGTCCACATACTTGC-3' for KLK12; sense 5'-CCTGAACCACGACCATGACA-3′ og anti-sense 5'-GCAGGGTTTGGATGTAGCCT-3' for KLK13; sense 5'-CCCAACTACAACTCCCGGAC-3' og anti-sense 5'-CCTGAAGCAACTGCTCGTGA-3' for KLK14; sense 5'-AGTTGCTGGAAGGTGACGAG- 3′ og anti-sense 5'-TGGCTAACATCTGGGCCTTG- 3′ for KLK15; sense 5'-GACAGTCAGCCGCATCTT CT-3′ og anti-sense 5'- GCGCCCAATACGACCAAA TC-3' for GAPDH. Cyklustærskelværdierne (Ct) for hvert KLK-gen blev normaliseret til GAPDH og analyseret med MxPro-softwaren.

In vivo antitumoraktivitet af A01 alene eller i kombination med sorafenib. BEL7404 cellesuspensionerne blev fremstillet (3 × 106 celler) og injiceret subkutant i højre flanke af athymiske nøgne mus. Ti dage efter podningen blev tumorbærende mus (kropsvægt(g):22-26; middel ± SEM:23,8 ± 0.14) screenet og udvalgt til randomisering i 7 behandlingsgrupper efter tumorvolumen ({ {12}} mm3). I alt 38 mus blev tildelt forskellige behandlingsgrupper (n=5 pr. gruppe undtagen modelgruppen (n=8)). Dyr blev derefter behandlet via oral sondeernæring med acteosid (A01; 12,5, 25 og 50 mg/kg), sorafenib alene (50 mg/kg) eller i kombination med A01 (50 mg/kg) én gang dagligt i 14 dage. Desuden blev en dosis på 20 mg/kg A01 også givet intravenøst. Doserne blev udvalgt baseret på tidligere undersøgelser og vores foreløbige data [15]. Tumorvæksten blev overvåget hver 3. eller 4. dag ved anvendelse af en elektronisk skydelære, med volumen beregnet som 0,5 x længde x bredde (mm3). Derudover blev et parallelt eksperiment med JHH-7-podning inkluderet. Syv dage efter inokulationen blev tumorbærende mus (legemsvægt(g):20-26; middel ± SEM:24,0 ± 0,20) screenet og udvalgt til randomisering i behandlingsgrupper i overensstemmelse med tumorvolumen (80-130 mm3 ). I alt 23 mus blev tildelt 4 behandlingsgrupper (n=5 pr. gruppe undtagen modelgruppen (n=8)). Dyrene modtog derefter A01 (20 mg/kg, iv), sorafenib alene (50 mg/kg, ig) eller kombineret med A01 (20 mg/kg, iv) en gang dagligt i 14 på hinanden følgende dage. Alle mus blev bedøvet med chloralhydrat (350 mg/kg) og aflivet ved nakkedislokation ved slutningen af ​​observationsperioden. Og tumormasse blev fjernet og afbildet med et digitalkamera.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). Medmindre andet er angivet, blev statistiske analyser udført under anvendelse af variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en posthoc Tukey-test. Tumorvolumenværdier er vist som middel ± standardfejl af middelværdien (SEM). To-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey-test blev brugt til at analysere tumorvolumendata. GraphPad Prism-softwaren blev brugt til statistiske analyser. En værdi på p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

Resultater

Effekter af A01 på proliferation og kolonidannelse af HCC'er in vitro

De tre HCC-cellelinjer (BEL7404, HLF og JHH7) blev brugt til celleproliferationsassayet. Som vist i fig. 1 afslørede MTT-assayet, at A01 inhiberede proliferationen af ​​alle de tre HCC-celler. For yderligere at spørge, om den antiproliferative aktivitet af A01 skyldtes dets evne til at inhibere celleklonogenicitet, blev kolonidannelsesassayet udført. A01 ved 100 μM viste stærk hæmning af kolonidannelse i BEL7404-celler (fig. 2a og b). Når det kombineres med sorafenib (2 μM), var hæmningsstyrken stærkere end for A01 eller sorafenib alene. Lignende resultater blev også set i de to andre HCC-celler, HLF og JHH-7 (fig. 2c og d).

Effekter af A01 alene eller i kombination med sorafenib på cellemigration af HCC'er in vitro

Vi evaluerede derefter cellemigration ved at bruge ridse-sårassayet. Som vist i fig. 3 forhindrede kombinationen af ​​A01 (100 eller 500 μM) og sorafenib (10 μM) signifikant sårheling i alle de tre HCC-celler sammenlignet med kontrolgruppen. For BEL7404-celler frembragte både A01 (100 eller 500 μM) og sorafenib (10 μM) kun en tendens til forebyggelse af sårheling uden statistisk signifikans (fig. 3a og d). For HLF-celler hæmmede A01 ved 500 μM og sorafenib ved 10 μM sårheling. Især A01 (500 μM) kombineret med sorafenib (10 μM) producerede en stærkere hæmning af sårheling end sorafenib alene (fig. 3b og e). For JHH-celler blev sårheling forhindret af A01 (500 μM) og sorafenib (10 μM). Kombinationen af ​​A01 (100 μM) og sorafenib (10 μM) gav en stærkere hæmning af sårheling end A01 (100 μM) eller sorafenib (10 μM) alene. Desuden viste A01 ved 500 μM kombineret med sorafenib (10 μM) en stærkere hæmning af sårheling end A01 (500 μM) eller sorafenib (10 μM) alene (fig. 3c og f).

Virkninger af A01 alene eller i kombination med sorafenib på angiogenese in vitro

Angiogenese er tæt forbundet med tumorvækst, -progression og metastaser [16], og betragtes derfor som et af de mellemliggende mål for kræftbehandling. Vi udførte først et rørdannelsesassay for at analysere den potentielle angiogenese in vitro. Som vist i fig. 4 begyndte behandling i 3 timer med sorafenib alene (10 μM) eller kombinationen af ​​A01 (100 og 500 μM) og sorafenib (10 μM) at vise hæmmende effekter på dannelsen af ​​karlignende strukturer, dvs. forlængelsen og justeringen af ​​HUVEC'erne (fig. 4a og c). Efter behandling i 8 timer hæmmede A01 (100 og 500 μM), sorafenib (10 μM) samt kombinationen af ​​A01 og sorafenib alle signifikant dannelsen af ​​karlignende strukturer, med stærkere hæmning af kombinationen af ​​A01 og sorafenib end A01 eller sorafenib alene (fig. 4a og c). Derudover er cellemigrationen af ​​HUVEC'er et nøgletrin til dannelse af nye kar under angiogenese og er derved undersøgt. Som vist i fig. 4b og d, hæmmede A01 (500 μM), sorafenib (10 μM) såvel som kombinationen af ​​A01 (100 og 500 μM) og sorafenib (10 μM) alle signifikant cellemigration af HUVEC'er. A01 (500 μM) kombineret med sorafenib (10 μM) gav stærkere hæmning end A01 (500 μM) eller sorafenib (10 μM) alene.

Effekter af A01 alene eller i kombination med sorafenib på in vivo tumorvækst af BEL7404 og JHH-7 HCC xenografter

For yderligere at evaluere effektiviteten af ​​A01 alene eller kombineret med sorafenib på in vivo tumorvækst af HCC etablerede vi en subkutan xenograft nøgenmusemodel ved hjælp af BEL7404 eller JHH-7 celler. Som vist i fig. 5 blev tumorvolumenet stærkt reduceret efter behandling med A01 (25 og 50 mg/kg, via oral sondeernæring; 20 mg/kg, via halevenen; alle p < 0,01="" vs.="" modelgruppe)="" eller="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" via="" oral="" sonde;="" p="">< 0,01="" vs.="" modelgruppe)="" alene="" (fig.="" 5a="" og="" b).="" kombinationen="" af="" ​​a01="" (50="" mg/kg)="" og="" sorafenib="" (50="" mg/kg)="" viste="" en="" stærkere="" hæmning="" af="" tumorvækst="" sammenlignet="" med="" sorafenib="" alene="" (p="">< 0,01),="" men="" frembragte="" en="" lignende="" effekt="" som="" a01="" alene="" (fig.="" 5a="" og="" c)="" ).="" vi="" brugte="" derefter="" jhh-7="" xenograft="" nøgne="" mus-modellen="" til="" yderligere="" at="" teste="" den="" mulige="" antitumor-effektivitet="" af="" a01.="" som="" vist="" i="" fig.="" 6="" frembragte="" behandling="" med="" a01="" (20="" mg/kg,="" iv)="" eller="" sorafenib="" (50="" mg/kg,="" ig)="" en="" signifikant="" hæmning="" af="" tumorvækst="" af="" jhh-7="" xenograft="" (p="">< 0,01="" vs.="" modelgruppe)="" ),="" med="" større="" inhibering,="" når="" de="" kombineres="" (fig.="" 6a="" og="" b;="" p="">< 0,01="" vs.="" a01="" eller="" sorafenib-gruppen="">

Mulig modulering af kallikrein-relateret peptidase og p53 vedActeosid fra cistanche

Den kallikrein-relaterede peptidase (KLK) er blevet foreslået som en cancerbiomarkør i diagnosticering og prognose af forskellige kræftformer, herunder hepatocellulært karcinom på grund af dets dysregulerede udtryk [17-19]. I dette scenarie opdagede vi genekspression af KLK1-15 i HCC JHH -7 cellelinjen. Som vist i fig. 7 producerede behandling med acteosid en signifikant hæmning af KLK1, 2, 4, 9 og 10 mRNA-niveauer (fig. 7a-e), uden signifikante ændringer af resten af ​​KLK1-15 (data ikke vist ). Derudover påviste vi også niveauet af tumorsuppressorprotein p53 og afslørede en stigning ved behandlingen med acteosid (fig. 7f).

Diskussion

Behandlingen af ​​fremskreden HCC har længe været vanskelig på grund af manglende evne til diagnosticering på tidligere stadier og tumorens kemoresistens [5, 6]. Sorafenib, multikinasehæmmeren rapporteret at hæmme celleproliferation og angiogenese, er sammen med en anden oral multikinasehæmmer lenvatinib blevet standardbehandlingen af ​​avanceret HCC [3, 5, 20, 21]. Imidlertid er de samlede overlevelsesrater beskedne i lyset af de lave responsrater og uegnethed i de kliniske omgivelser [3, 22]. En nylig undersøgelse viste, at atezolizumab plus bevacizumab gav bedre kliniske resultater end sorafenib hos patienter med uoperabelt HCC, hvilket gør denne kombination til en mulig ny førstelinjebehandlingsmulighed for avanceret HCC [7]. I denne sammenhæng har vi identificeret, at phenylethanoid glycoside,Acteosid fra cistanchehæmmet celleproliferation, kolonidannelse og migration i de tre humane HCC-cellelinjer BEL7404, HLF og JHH-7 samt forbudt angiogenese af HUVEC'er. Kombinationen af ​​acteosid og sorafenib gav stærkere hæmning af cellekolonidannelse og migration af HCC-cellerne såvel som angiogenese af HUVEC'er. Acteosid præsenterede antitumoreffektiviteten i BEL7404- eller JHH-7 xenograft-nøgne mus-modellen, med en forbedring, når det kombineres med sorafenib, til at hæmme væksten af ​​JHH-7 xenograft. Yderligere analyser afslørede en stigning i p53 såvel som et fald i nogle KLK-gener. I overensstemmelse hermed bør den mulige anvendelse af acteosid som supplement til behandling af fremskreden HCC i klinikken overvejes.

Montering af beviser har vist antitumorvirkningerne afActeosid fra cistanchei forskellige tumorceller såsom B16 melanomceller, glioblastomceller, kolorektale cancerceller, orale pladecellecarcinomceller, prostatacancerceller og humane brystadenokarcinomceller [11-13, 23-25] eller hos dyr, der bærer tumorer [12]. På trods af dette har få undersøgelser fokuseret på virkningerne af acteosid på HCC in vitro eller in vivo, bortset fra en undersøgelse, der bruger diethylnitrosamin som carcinogen til at inducere hepatocarcinogenese hos rotter og afsløre kemoforebyggelsen med acteosid [26]. I den nuværende undersøgelse viste vi inhiberingen af ​​acteosid af celleproliferation, kolonidannelse og migration i HCC-cellelinjer samt tumorvækst i mus, der bærer HCC-cellelinjexenografter, og demonstrerede derved direkte antitumorvirkningerne af acteosid i HCC. Desuden gav kombinationen af ​​acteosid og sorafenib endnu stærkere antitumoreffekter. Kombineret med evidensen for, at acteosid er beskyttende mod leverskader [27-29] uden toksiske virkninger hos dyr og uden mutagenicitet [30], ser det ud til at være muligt for den fremtidige anvendelse af kombinationsbehandlingen af ​​acteosid og sorafenib hos patienter med fremskreden HCC i klinikken.

Den humane kallikrein-familie omfatter 15 homologe, enkeltkædede, udskilte trypsin- eller chymotrypsin-lignende serinproteaser (KLK1-15) og har været impliceret i reguleringen af ​​tumorvækst, neoplastisk progression, angiogenese og metastaser [18, 31]. Især er KLK'erne blevet foreslået som en cancerbiomarkør i diagnosticering og prognose af forskellige kræftformer, herunder hepatocellulært karcinom på grund af dets dysregulerede udtryk [17-19]. For eksempel foreslås KLK1 som biomarkør for gastrisk cancer på grund af forhøjelsen af ​​KLK1-niveauer i gastrisk neoplasma og forebyggelse af tumorvækst i mavekræft ved inhibering af KLK1-aktivitet med kallikrein-bindende protein (KBP) [32]. I dette scenarie observerede vi en signifikant hæmning af KLK mRNA-niveauer af acteosid (KLK1, 2, 4, 9 og 10). Anvendelse af KBP, som specifikt binder til vævskallikrein og hæmmer kallikreinaktivitet, blev rapporteret at undertrykke væksten af ​​HCC i mus muligvis via dets anti-angiogene aktivitet [33], hvilket tyder på den mulige involvering af KLK'er i progressionen af ​​HCC. Derudover er tumorsuppressorproteinet p53 i stand til at inducere senescens, apoptose såvel som cellecyklusstandsning. Øget p53-ekspression giver øget kemosensitivitet i cancerceller [34]. I denne henseende viste vores vestlige resultater en stigning i p53-niveauer efter behandling med acteosid. Samlet set er det rimeligt at udlede, at acteosid udøver antitumorvirkningerne på HCC muligvis gennem dets opregulering af p53 samt hæmning af KLK og angiogenese.

Det skal bemærkes, at det direkte molekylære mål, hvortilActeosid fra cistanchekan direkte binde er stadig uklart. Vores foreløbige data ved hjælp af molekylær docking afslørede direkte binding af acteosid med kallikrein (data ikke vist). Yderligere eksperimenter ville være nødvendige for at afklare denne formodning. Derudover, hvad angår doser af acteosid, der blev brugt til celleassay i undersøgelse 10–50 gange højere end sorafenibs (10 μM), valgte vi for det første disse doser af acteosid i overensstemmelse med dosis-respons-forhold i MTT-assayet. For det andet var de doser, vi brugte (100, 500 μM), sammenlignelige med tidligere undersøgelser [35], hvor acteosid (100 μM) hæmmede celleproliferation af kolorektale cancerceller. Til sidst, på trods af den højere dosis i celleassayet, producerede acteosid en udtalt hæmning af tumorvækst i HCC xenograft nøgne mus-modellen i vores undersøgelse (25 og 50 mg/kg), idet virkningerne ligner sorafenib (50 mg/kg). For sorafenib blev det brugt i vores undersøgelse i en dosis på 10 μM på cellulært niveau. Denne dosis er sammenlignelig med tidligere undersøgelser, hvor sorafenib viste sig at hæmme cellelevedygtigheden med en IC50 på 4,0-6,5 μM i HCC-cellelinjerne i PLC/PRF/5- og HepG2-celler. I modsætning hertil var dosen af ​​sorafenib, der blev brugt til at undertrykke væksten af ​​HCC-xenografter i SCID-hunmus, 30 mg/kg (po ved sonde) [36]. I klinikken er den anbefalede dosis sorafenib til patienten 400 mg pr. gang (2*0,2 g), to gange dagligt (i alt 800 mg pr. dag). Denne dosering for sorafenib, der anvendes i klinikken, er i modsætning til den, der anvendes i celleassay (IC50-værdi i μM-niveau), muligvis på grund af dets dårlige optagelighed under in vivo-betingelser. For acteosid er dens ækvivalente dosis for mennesker (60 kg lgv) ca. 250 mg baseret på doseringen til mus (50 mg/kg, ig). Denne dosis er sammenlignelig med den af ​​sorafenib, der anvendes i klinikken og bør være acceptabel for patienterne.

Konklusioner Afslutningsvis,Acteosid fra cistancheer i stand til at udøve en antitumoreffekt i HCC-cellelinjer og i nøgne mus, der bærer HCC-cellelinjexenotransplantater, effekter muligvis via stigende p53-niveauer samt at forbyde KLK og angiogenese. Acteosid kunne være nyttigt som et supplement til behandling af fremskreden HCC i klinikken.

Referencer

1 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancerstatistik 2018: GLOBOCAN estimater af incidens og dødelighed på verdensplan for 36 cancerformer i 185 lande. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394–424..

2. Llovet JM, Zucman-Rossi J, Pikarsky E, Sangro B, Schwartz M, Sherman M, Gores G. Hepatocellulært karcinom. Nat Rev Dis Primere. 2016;2:16018.

3. Sim HW, Knox J. Hepatocellulært karcinom i immunterapiens æra. Curr Probl Kræft. 2018;42(1):40–8. 4. Jiang Y, Han QJ, Zhang J. Hepatocellulært karcinom: mekanismer for progression og immunterapi. World J Gastroenterol. 2019;25(25):3151-67.

5. Forner A, Da Fonseca LG, Diaz-Gonzalez A, Sanduzzi-Zamparelli M, Reig M, Bruix J. Kontroverser i håndteringen af ​​hepatocellulært karcinom. JHEP Rep. 2019;1(1):17–29.

6. Hartke J, Johnson M, Ghabril M. Diagnosticering og behandling af hepatocellulært karcinom. Semin Diagn Pathol. 2017;34(2):153–9.

7. Finn RS, Qin S, Ikeda M, Galle PR, Ducreux M, Kim TY, Kudo M, Breder V, Merle P, Kaseb AO, et al. Atezolizumab plus Bevacizumab i uoperabelt hepatocellulært karcinom. N Engl J Med. 2020;382(20):1894-905.

8. He ZD, Ueda S, Akaji M, Fujita T, Inoue K, Yang CR. Monoterpenoid og phenylethanoid glycosider fra Ligustrum peduncular. Fytokemi. 1994;36(3):709-16.

9. Li H, Chou GX, Wang ZT, Hu ZB. HPLC-bestemmelse afakteosidi Radix Rehmanniae. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006;31(10):822–4.

10. Wong IY, He ZD, Huang Y, Chen ZY. Antioxidative aktiviteter af phenylethanoidglycosider fra Ligustrum purpurascens. J Agric Food Chem. 2001;49(6):3113-9.

11. Mulani SK, Guh JH, Mong KK. En generel syntetisk strategi og anti-spredningsegenskaberne på prostatacancercellelinjer for naturlige phenylethanoidglykosider. Org Biomol Chem. 2014;12(18):2926–37.

12. Cheimonidi C, Samara P, Polychronopoulos P, Tsakiri EN, Nikou T, Myrianthopoulos V, Sakellaropoulos T, Zoumpourlis V, Mikros E, Papassideri I, et al. Selektiv cytotoksicitet af urtestoffet acteosid mod tumorceller og dets mekanistiske indsigt. Redox Biol. 2018;16:169-78.

13. Attia YM, El-Kersh DM, Wagdy HA, Elmazar MM. Verbascoside: identifikation, kvantificering og potentiel sensibilisering af kolorektale cancerceller over for 5-FU ved at målrette PI3K/AKT-vejen. Sci Rep. 2018;8(1):16939.

14. Liu S, Zhao Z, Huo Z, Xu Z, Zhong Y, Wang X, Yang Y, Wang Z. Osmanthus fragrans blomsterekstrakt og dets berigede acteosid hæmmer melanogenese og ultraviolet-induceret pigmentering. Nat Prod Commun. 2018;13(5):575–80.

15. Wang J, Ma S, Chen X, Zhang S, Wang Z, Mei Q. Den nye PI3K-hæmmer S1 synergerer med sorafenib i ikke-småcellede lungecancerceller, der involverer Akt-S6-signalering. Undersøg nye stoffer. 2019;37(5):828–36.

16. Hanahan D, Weinberg RA. Kræftens kendetegn: den næste generation. Celle. 2011;144(5):646–74. 17. Emami N, Diamandis EP. Anvendelighed af kallikrein-relaterede peptidaser (KLK'er) som cancerbiomarkører. Clin Chem. 2008;54(10):1600–7.

18. Tailor PD, Kodeboyina SK, Bai S, Patel N, Sharma S, Ratnani A, Copland JA, She JX, Sharma A. Diagnostisk og prognostisk biomarkørpotentiale af kallikrein-familiegener i forskellige cancertyper. Oncotarget. 2018;9(25): 17876–88.

19. Kontos CK, Mavridis K, Talieri M, Scorilas A. Kallikrein-relaterede peptidaser (KLK'er) i gastrointestinal cancer: mekanistiske og kliniske aspekter. Thromb Haemost. 2013;110(3):450–7.

20. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, et al. Effekt og sikkerhed af sorafenib hos patienter i Asien-Stillehavsområdet med fremskreden hepatocellulært karcinom: et fase III randomiseret, dobbeltblindt, placebokontrolleret forsøg. Lancet Oncol. 2009;10(1):25–34. 21. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, et al. Sorafenib i avanceret hepatocellulært karcinom. N Engl J Med. 2008;359(4):378–90.

22. Sang MJ. Hepatisk arterie infusion kemoterapi til avanceret hepatocellulært karcinom. World J Gastroenterol. 2015;21(13):3843–9.

23. Liao YF, Rao YK, Tzeng YM. Vandigt ekstrakt af Anisomeles India og dets oprensede forbindelse udøver anti-metastatisk aktivitet gennem hæmning af NF kappaB/AP-1-afhængig MMP-9-aktivering i humane brystkræft MCF-7-celler. Food Chem Toxicol. 2012;50(8):2930–6.

24. Zhang Y, Yuan Y, Wu H, Xie Z, Wu Y, Song X, Wang J, Shu W, Xu J, Liu B, et al. Virkning af verbascoside på apoptose og metastase i humant oralt planocellulært karcinom. Int J Kræft. 2018;143(4):980–91.

25. Hwang TW, Kim DH, Kim DB, Jang TW, Kim GH, Moon M, Yoon KA, Choi DE, Park JH, Kim JJ. Synergistisk anticancereffekt af acteosid og temozolomid-baseret glioblastom kemoterapi. Int J Mol Med. 2019; 43(3):1478–86.

26. Peerzada KJ, Faridi AH, Sharma L, Bhardwaj SC, Satti NK, Shashi B, Tasduq SA. Acteosid-medierer kemoforebyggelse af eksperimentel levercarcinogenese gennem STAT-3 reguleret oxidativt stress og apoptose. Environ Toxicol. 2016;31(7):782–98.

27. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolitter af diætakteosid: profiler, isolation, identifikation og leverbeskyttende kapacitet. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.

28. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteosid hæmmer apoptose ved D-galactosamin og lipopolysaccharid-induceret leverskade. Life Sci. 1999;65(4):421-30.

29. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, Huang Y. Akteosids beskyttende virkning på immunologisk leverskade induceret af Bacillus Calmette Guerin plus lipopolysaccharid. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.

30. Lu B, Li M, Zhou F, Huang W, Jiang Y, Mao S, Zhao Y, Lou T. Den Osmanthus duftende blomst phenylethanoid glycosid-rige ekstrakt: akutte og subkroniske toksicitetsundersøgelser. J Ethnopharmacol. 2016;187:205-12.

31. Diamandis EP, Yousef GM. Humant væv kallikreins: en familie af nye cancerbiomarkører. Clin Chem. 2002;48(8):1198-205.

32. Sawant S, Snyman C, Bhoola K. Sammenligning af vævskallikrein og kininreceptorekspression i mavesår og neoplasmer. Int Immunopharmacol. 2001;1(12):2063-80.

33. Lu L, Yang Z, Zhu B, Fang S, Yang X, Cai W, Li C, Ma JX, Gao G. Kallikreinbindingsprotein undertrykker væksten af ​​hepatocellulært karcinom ved antiangiogen aktivitet. Cancer Lett. 2007;257(1):97-106.

34. Guntur VP, Waldrep JC, Guo JJ, Selting K, Dhand R. Forøgelse af p53-protein sensibiliserer ikke-småcellet lungekræft over for paclitaxel og cisplatin in vitro. Anticancer Res. 2010;30(9):3557–64.

35. Zhou L, Feng Y, Jin Y, Liu X, Sui H, Chai N, Chen X, Liu N, Ji Q, Wang Y, Li Q. Verbascoside fremmer apoptose ved at regulere HIPK2-p53-signalering hos mennesker kolorektal cancer. BMC Cancer. 2014;14:747.

36. Liu L, Cao Y, Chen C, Zhang X, McNabola A, Wilkie D, Wilhelm S, Lynch M, Carter C. Sorafenib blokerer RAF/MEK/ERK-vejen, hæmmer tumorangiogenese og inducerer tumorcelleapoptose i hepatocellulær carcinom model PLC/PRF/5. Cancer Res. 2006;66:11851-8.