En hurtig TLC-billede digitaliseringsmetode til simultan kvalitetsanalyse af fire store phenylethanoidglycosider i Cistanche

Abstrakt

Denne undersøgelse etablerede en tynd-lagskromatografi (TLC) metode baseret på billeddigitalisering til hurtig, enkel og billig påvisning af fire store phenylethanoid glycosider (PhG'er) i Cistanche. De fire PhG'er blev ekstraheret med 50 % methanol og adskilt på en polyamidplade med en mobil fase bestående af methanol-chloroform-iseddike-vand (3,5:1,5:1:7, V/V/V/V). Spotbilleder blev optaget under 365 nm UV-lys og digitalt analyseret ved hjælp af ImageJ-software, som genererede integrerede gråværdier til hurtig kvantitativ analyse. Metoden viste fremragende linearitet forechinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosidmed korrelationskoefficienter (r) på henholdsvis 0,9974, 0,9931, 0,9923 og 0,9890. Genopretninger varierede fra henholdsvis 87,1 % til 96,5 %, 88,4 % til 109,7 %, 94,1 % til 105,1 % og 97,0 % til 115,1 %. De kvantitative resultater opnået ved denne metode var i overensstemmelse med resultaterne fra højtydende væskekromatografi (HPLC). Denne undersøgelse giver en hurtig og nøjagtig metode til kvantitativ analyse af fire vigtige PhG'er i Cistanche.

Nøgleord:Cistanche tubulosa; phenylethanoid glycosider; tyndtlagskromatografi; ImageJ; hurtig cistanche kvalitetsanalyse

Cistancheekstrakt med højt indhold af echinacosid

Cistanche application

1. Introduktion

Cistanche er en flerårig parasitisk urt af Orobanchaceae-familien, der primært findes i Xinjiang, Indre Mongoliet og Ningxia-regionerne i Kina. Som en planteressource med både medicinsk og spiselig værdi har dens tørrede sukkulente stængler vist et betydeligt økonomisk potentiale på tværs af flere industrier. Blandt de forskellige Cistanche-arter,Cistanche deserticolaogCistanche tubulosaer officielt opført iKinesisk farmakopé, mens begge arter sammen medCistanche salsa, er anerkendt som det rå lægemiddel "Nikujuyou" i den japanske farmakopé. Desuden spiller Cistanche en afgørende rolle i at forbedre det økologiske miljø i tørre områder, da dets samplantning med værtsplanter giver betydelige økologiske og økonomiske fordele til ørken- og halvørkenområder.

Cistanche-ekstrakt med et specifikt indhold af flavonoid

Cistanche application

I traditionel kinesisk medicin (TCM) er Cistanche højt anset som en fremragende tonic. I 2020 blev det godkendt som en ny fødevareingrediens i Kina, hvilket markant udvidede sit marked og produktudvikling. Cistanche bruges ikke kun til at behandle nyre-yang-mangel, blod- og essensudtømning, impotens og infertilitet og forstoppelse, men viser også et lovende potentiale til behandling af leverfibrose. Kemiske sammensætningsundersøgelser har identificeret phenylethanoidglycosider (PhG'er) som en af de vigtigste aktive komponenter i Cistanche. Disse forbindelser - inklusive echinacosid, acteosid, tubulosid A og isoacteosid - udviser en bred vifte af farmakologiske virkninger, herunder anti-aging, antioxidant, anti-træthed og afføringsegenskaber. Echinacosid og acteosid er de officielle markørkomponenter til kvalitetskontrol af Cistanche i farmakopéstandarder. Tubulosid A udviser betydelige anti-inflammatoriske og antioxidante aktiviteter, mens isoacteosid er blevet forbundet med kognitiv forbedring og cytobeskyttende virkning.

Traditionelle analysemetoder til PhG'eri Cistanche omfatter højtydende væskekromatografi (HPLC), ultrahøjtydende væskekromatografi (UPLC) og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS). Disse metoder er imidlertid afhængige af dyr instrumentering, kræver tidskrævende prøveforberedelse og kræver meget dygtige operatører. Selvom nær-infrarød (NIR) spektroskopi tilbyder et hurtigt og ikke-destruktivt alternativ, afhænger den stadig af store NIR-instrumenter og er ikke let bærbar. Derfor er der et presserende behov for en billig, nem at betjene og bærbar metode, der er egnet til on-site kvalitativ og kvantitativ analyse, især til primære testapplikationer.

I de senere år har fremskridt inden for computervisionsteknologi muliggjort billedgenkendelse og -behandling for at forbedre traditionelle analytiske teknikker, hvilket gør TLC til en effektiv kvantitativ metode. Denne tilgang korrelerer den grå værdi af prøvepletter med deres koncentration. ImageJ, en open source billedbehandlingssoftware, skiller sig ud for sin brugervenlighed og alsidighed. For eksempel har Bai et al. udviklet en TLC-ImageJ-metode til kvantificering af aminosmørsyre (GABA) i ris, der validerer gennemførligheden af denne tilgang til billedbaseret kvantitativ analyse.

I denne undersøgelse fangede vi TLC-spotbilleder af fire store PhG'er i Cistanche, etablerede et lineært forhold mellem PhG-indhold og integrerede gråværdier og opnåede kvantitativ analyse af alle fire forbindelser. Denne tilgang tilbyder en ny løsning til hurtig, billig detektion på stedet og rummer et bredt anvendelsespotentiale.

Om Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.- verdens største Cistanche-forarbejdningsvirksomhed med en 200.000 hektar stor Cistanche-dyrkningsbase, en GMP-fabrik, der er i stand til at behandle 20.000 tons frisk Cistanche årligt, og over 14 patenter relateret til Cistanche-ekstraktionsteknologier, herunder avanceret membranseparationsteknologi. Vi er specialiserede i Cistanche-ekstrakter, der stammer fra Hotan, Xinjiang, og vores produkter opfylder internationale kvalitetsstandarder i USA og EU. Vigtigt, vi fokuserer påCistanche tubulosaekstrakt, som naturligt indeholder et højere indhold af phenylethanoid glycosider, herunder echinacosid, acteosid, tubulosid A og isoacteosid, hvilket gør det til det overlegne valg til nutraceutiske og funktionelle fødevarer.

Cistanche-ekstrakt med et specifikt indhold af acteosid

Acteoside in Cistanche Cistanche application

2. Materialer og metoder

2.1 Instrumenter og reagenser

Udstyr:1000T multifunktionel kværn (MinYe Industry and Trade Co., Yongkang, Kina); AB135‑S analytisk balance (Mettler-Toledo, Schweiz); GAMAG LINOMAT 5 semi-automatisk spotter (CAMAG, Schweiz); UV-lampe (CAMAG, Schweiz); 1200 serie HPLC-system (Agilent, USA); Avanceret-III-18W ultrarent vandsystem (Tang's Kangning Technology, Chengdu, Kina); polyamid-TLC-plader (10 cm × 10 cm, 10 cm × 20 cm; Sijia Biochemical Plastics, Taizhou, Kina); dobbelt-trough fremkalderkammer (200 mm × 200 mm).

Reagenser:Methanol (analytisk kvalitet, Beilian Fine Chemicals, Tianjin, Kina); methanol og acetonitril (kromatografikvalitet, Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina); iseddikesyre (analytisk kvalitet, Zhiyuan Chemical Reagents, Tianjin, Kina); myresyre og chloroform (analytisk kvalitet, Damao Chemical Reagents, Tianjin, Kina); ultrarent vand. Echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid referencestandarder (renhed større end eller lig med 98 %, Yinglai Technology, Beijing, Kina).

Eksempler:Friske Cistanche-prøver blev hentet fra Xinjiang, Kina, og behandlet af Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd. I alt 51 batcher afCistanche tubulosaog 8 partier afCistanche deserticolablev opsamlet, skåret i skiver, tørret, formalet til pulver og forseglet til opbevaring.

Billedopsamling:iPhone 15 Pro (12MP opløsning, F2.2 blænde, 2× optisk zoom).Billeddigitaliseringssoftware:F Color Picker (Deweibo) og ImageJ (version 1.54p, National Institutes of Health, USA).

2.2 Eksperimentelle metoder

2.2.1 Forberedelse af referencestandardløsninger

Echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid referencestandarder blev nøjagtigt vejet, opløst i 50% (V/V) methanol og fortyndet til volumen i 10 ml kolber for at opnå stamopløsninger i koncentrationer på henholdsvis 1,003, 1,007, 1,004, og 1,004 mg/l.

Alikvoter af hver stamopløsning (echinacosid 2 ml, tubulosid A 0,5 ml, acteosid 1 ml, isoacteosid 0,5 ml) blev overført til en 10 ml kolbe, fortyndet til volumen med 50 % methanol og filtreret gennem en 0,22 μm, der indeholdt en 20 ml-standard membran, 2-referenceopløsning. henholdsvis 52,40, 101,12 og 51,14 ug/ml.

2.2.2 Forberedelse af testprøveopløsninger

Cistanche-prøver blev skåret i skiver, tørret og formalet til at passere gennem en 0,425 mm sigte. C. tubulosa-pulver (0,5 g) eller C. deserticola-pulver (1,0 g) blev nøjagtigt vejet, blandet med 30 ml 50 % methanol, sonikeret i 40 minutter og vejet igen for at kompensere for ethvert vægttab. Opløsningen blev filtreret gennem en 0,22 μm membran for at opnå testprøveopløsningen.

2.2.3 TLC-udvikling af opløsningsmiddelvalg

Baseret på opløsningsmiddelpolaritet, elueringsstyrke og foreløbige eksperimentelle resultater blev tre udviklende opløsningsmiddelsystemer evalueret:

System 1: Methanol-iseddikesyre-vand (2:1:7, V/V)

System 2: Methanol-chloroform-iseddikesyre-vand (2:1,5:1:7, V/V)

System 3: Methanol-chloroform-iseddikesyre-vand (3,5:1,5:1:7, V/V)

Alikvoter (5 μL hver) af den blandede referencestandardopløsning og testprøveopløsning blev påført som bånd på polyamid-TLC-plader. Efter udvikling blev pladerne tørret, og retardationsfaktorerne (Rf-værdier) blev beregnet.

2.2.4 Billedopsamling og -behandling

TLC-plader blev fikseret og undersøgt under 365 nm UV-lys. En iPhone 15 Pro monteret på et stativ blev brugt til at tage billeder fra en ensartet vinkel og højde. F Color Picker og ImageJ-software blev brugt til digital kvantitativ analyse, der konverterede TLC-billeder til RGB-værdier, spidsområder og integrerede gråværdier. Baggrundssubtraktion og billedinversion blev udført ved hjælp af ImageJ. Billederne blev derefter konverteret til 8-bit gråtoner, re-inverteret og kontrastjusteret til visualisering. Målbånd blev udvalgt til integrationsanalyse ved hjælp af grå værdier til kvantificering.

Specifikationsliste for Cistanche-ekstrakt

cistanche specification Cistanche application

Besøg Cistanche World Shop

3. Resultater og diskussion

3.1 Valg af udviklende opløsningsmiddel

Rf-værdierne for de fire PhG'er blev systematisk sammenlignet på tværs af de tre testede udviklende opløsningsmidler. Opløsningsmiddelsystem 1 og 2 viste utilstrækkelig polaritet, hvilket resulterede i pletter, der ikke migrerede ud over halvdelen af pladehøjden og dårlig adskillelse. Solvent System 3 (methanol-chloroform-iseddike-vand, 3,5:1,5:1:7, V/V/V/V) gav skarpe og klart adskilte pletter med Rf-værdier på 0,67 (echinacosid), 0,38 (tubulosid A), 0,28 (acteosid), (acteoside), (acteoside), (acteoside). Derfor blev System 3 valgt til alle efterfølgende TLC-analyser.

3.2 Metodevalidering

3.2.1 Valg af kalibreringskurve og billedbehandlingsmetode

Blandede referencestandardopløsninger ved fem koncentrationsniveauer blev fremstillet, og 5 μL af hver blev analyseret ved TLC. Billeder blev behandlet ved hjælp af ImageJ, og kalibreringskurver blev konstrueret ved at plotte koncentration (x, ug/ml) mod integreret gråværdi (y). De lineære områder var 21-210 ug/mL for echinacosid, 5,2-52 ug/mL for tubulosid A, 10,1-101 ug/mL for acteosid og 5,2-52 ug/ml for isoacteosid.

Tre billeddigitaliseringsmetoder blev sammenlignet:

Integreret gråværdi– ved hjælp af ImageJ til at måle gennemsnitlig spotgråværdi × pixelområde (Ctrl + M).

Topområde– generering af konturplot og måling af punktspidsareal ved hjælp af stavværktøjet.

RGB-værdier– brug af F-farvevælger til at opnå R-, G-, B-kanalintensiteter i spotcentret med optimerede kombinationer (2G+B for echinacosid, R for tubulosid A, 2R+G for acteosid og isoacteosid).

Blandt disse metoder gav den integrerede gråværditilgang de højeste korrelationskoefficienter (r Større end eller lig med 0,9890), hvilket indikerer overlegen nøjagtighed for TLC-billeddigitalisering.

3.2.2 Grænser for detektion og kvantificering

LOD og LOQ blev beregnet som LOD=3.3σ/S og LOQ=10σ/S (hvor σ=standardafvigelse af skæringspunktet og S=hældning af kalibreringskurven). LOD-værdierne var 0,041 ug/bånd (echinacosid), 0,005 ug/bånd (tubulosid A), 0,008 ug/bånd (acteosid) og 0,011 ug/bånd (isoacteosid). De tilsvarende LOQ-værdier var henholdsvis 0,138, 0,017, 0,026 og 0,037 ug/bånd.

3.2.3 Præcision, stabilitet og gentagelighed

Den relative standardafvigelse (RSD) af integrerede gråværdier for de fire PhG'er varierede fra 0,56% til 2,4% for præcision, 0,76% til 2,2% for stabilitet og 0,61% til 1,9% for repeterbarhed, hvilket alt sammen indikerer god metodepræstation.

3.2.4 Genopretning

Gennemsnitlige genfindinger varierede fra 87,1 % til 96,5 % (echinacosid), 88,4 % til 109,7 % (tubulosid A), 94,1 % til 105,1 % (acteosid) og 96,9 % til 115,1 % (isoacteosid), hvilket viser tilfredsstillende nøjagtighed.

3.3 Real prøveanalyse: TLC-ImageJ vs. HPLC

TLC-ImageJ-metoden blev anvendt til at kvantificere de fire phG'er i 51 batches afCistanche tubulosaog 8 partier afCistanche deserticola. Kvantitative resultater blev valideret mod HPLC-analyse ved hjælp af parrede t-tests, som ikke viste nogen statistisk signifikante forskelle mellem de to metoder for alle fire PhG'er i C. tubulosa og for echinacosid og acteosid i C. deserticola (P > 0,05).

Resultaterne bekræftede, at TLC-ImageJ nøjagtigt kan kvantificere ikke kun farmakopémarkørkomponenterne (echinacosid og acteosid), men også tubulosid A og isoacteosid, som typisk ikke indgår i rutinemæssig kvalitetskontrol. Den gode overensstemmelse mellem TLC-ImageJ og HPLC validerer gennemførligheden af denne hurtige analytiske tilgang til Cistanche kvalitetsanalyse.

3.4 Fordele ved TLC-ImageJ-metoden til Cistanche-kvalitetsanalyse

TLC-ImageJ-metoden tilbyder flere vigtige fordele:

Intet yderligere farvningstrin– pletter er direkte synlige under 365 nm UV-lys som blå fluorescens.

Høj gennemstrømning– 8–10 prøver kan analyseres samtidigt på en enkelt TLC-plade.

Hurtig analyse– fuldfør kvantitativ analyse inden for 30 minutter.

Bærbar og billig– kræver kun grundlæggende TLC-udstyr og en smartphone, hvilket eliminerer afhængigheden af faste laboratoriefaciliteter.

Alsidig– gælder for flere phG'er ud over farmakopémarkører, hvilket muliggør omfattende kvalitetsanalyse.

ForCistanche tubulosaekstraktleverandører som Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., giver denne metode et praktisk værktøj til hurtig analyse af proces- og slutproduktkvalitet, hvilket sikrer ensartet PhG-indhold på tværs af batcher for at opfylde de høje standarder, der forventes af den nutraceutiske, funktionelle fødevare- og farmaceutiske industri på det amerikanske og europæiske marked.

cistanche quality

4. Konklusion

Denne undersøgelse etablerede en TLC billeddigitaliseringsmetode til hurtig kvantitativ analyse af fire store phenylethanoidglycosider i Cistanche: echinacosid, tubulosid A, acteosid og isoacteosid. Metoden stemmer overens med målforbindelsernes fysisk-kemiske egenskaber, kræver ingen yderligere farvning og muliggør samtidig analyse af 8-10 prøver på en enkelt TLC-plade inden for 30 minutter. De kvantitative resultater opnået ved denne metode er i overensstemmelse med dem fra HPLC, hvilket validerer dens nøjagtighed og pålidelighed.

Metoden er særligt velegnet til primære testapplikationer og feltbaserede kvalitetsanalyser, da den er afhængig af bærbart, billigt udstyr og reducerer afhængigheden af laboratorieinfrastruktur. Det er allerede blevet implementeret i Cistanche-dyrknings-, forarbejdnings- og forskningsfaciliteter i Xinjiang, Kina, hvilket viser dens praktiske nytte.

Wecistanche Fabrik til dyrkning og forarbejdning af cistanche

zhongnanshan

Supportive Service Of Wecistanche-For flere detaljer om samarbejde
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., verdens største Cistanche-forarbejdningsvirksomhed, er stolte af at anvende og promovere denne avancerede, men alligevel tilgængelige kvalitetsanalysemetode. Med vores 200.000 hektar store Cistanche-base, GMP-certificerede produktionsfaciliteter og state-of-the-art membranseparationsteknologier, leverer vi premiumCistanche tubulosaekstrakter med naturligt højere niveauer af phenylethanoidglycosider op til brancheførende specifikationer. Vores produkter opfylder amerikanske og EU's internationale kvalitetsstandarder og er velegnede til en lang række anvendelser, herunder TCM-afkog, funktionelle fødevarer, sundhedsprodukter, kosttilskud, lægemidler og kosmetik.

Efterhånden som den globale efterspørgsel efter Cistanche-tilskud fortsætter med at vokse - med markedet, der forventes at nå op på 1,13 milliarder dollars i 2033, drevet af stigende forbrugerinteresse i naturlige produkter mod aldring, kognitiv sundhed og vitalitet - bliver vigtigheden af pålidelige, hurtige kvalitetsanalysemetoder altafgørende. TLC-ImageJ-metoden, der præsenteres her, giver en praktisk løsning for producenter, leverandører og tilsynsorganer for at sikre ensartet produktkvalitet og derved understøtte den fortsatte udvidelse af Cistanche-industrien i USA, Europa og videre.