Et nyt netrin-1-afledt peptid forbedrer beskyttelsen mod neuronal død og dæmper intracerebral blødning i mus, del 3

Behandlingsgrupper af saltvand, TAT eller TE1 (opløst i saltvand) blev givet til mus med 2 skafter ICH og hver dag i 5 dage ved intraperitoneal injektion i et samlet volumen på 0,1 ml pr. dyr. Peptider blev givet på en blind måde i doser på 12 mg/kg.

Fysiologisk saltvand er en almindeligt anvendt fysiologisk buffer, der er meget brugt i medicinske og biologiske eksperimenter. Men vidste du det? Fysiologisk saltvand kan også forbedre vores hukommelse!

Først og fremmest spiller fysiologisk saltvand en vigtig rolle i cellernes normale funktion. Det kan opretholde normalt celleosmotisk tryk og opretholde cellernes normale morfologi og funktion. I hjernen har en lang række nerveceller brug for fysiologisk saltvand som grundstof, og tilskud af fysiologisk saltvand kan fremme hjernecellernes normale funktion, give tilstrækkelig ilt og næringsstoffer til hjernen og gøre hjernen sundere.

For det andet kan fysiologisk saltvand fremme signaltransmission mellem hjerneneuroner og forbedre hjernens indlæringsevne. Undersøgelser har vist, at i processen med opgavelæring kan injektion af fysiologisk saltvand forbedre elevernes indlæringseffekt betydeligt og forbedre elevernes følelsesmæssige tilstand, reducere indlæringsangst og stress. Samtidig kan fysiologisk saltvand også øge antallet af neuroner og kompleksiteten af ​​neuroner i hippocampus, hvilket er befordrende for dannelse og vedligeholdelse af hukommelse.

Derudover kan fysiologisk saltvand forbedre det metaboliske miljø i hjernen og reducere forskellige skadelige virkninger på hjernen, såsom skader, læsioner, iskæmi og hypoxi. Det er faktorer, der kan skade hjernen, og indsprøjtning af fysiologisk saltvand kan øge hjernens mestringsevne og mindske dens skader og derved forbedre hjernens hukommelse og tænkeevne.

Generelt er saltvand et ideelt stof til at forbedre hukommelsen. Det kan have flere positive virkninger på hjernen, herunder at øge antallet og kompleksiteten af ​​neuroner, forbedre det metaboliske miljø og fremme signaltransmission mellem neuroner. Derfor, når vi skal forbedre vores hukommelse, kan vi lige så godt overveje at injicere saltvand for at give bedre beskyttelse og støtte til vores hjerne. Det kan ses, at vi skal forbedre vores hukommelse, og Cistanche kan forbedre vores hukommelse markant, fordi den også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer, som er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelig næring og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på, hvordan du kan forbedre din hukommelse

4.13. Collagenase-induceret musemodel af ICH

Kollagenase-injektion bruges almindeligvis til at inducere ICH [60]. C57BL/6-hanmus (8 til 12 uger gamle) blev bedøvet med isofluran (2 til 5%) og anbragt på en stereotaksisk ramme.

Under proceduren blev kropstemperaturen for hvert dyr holdt ved 37 ◦C med et homøotermisk tæppe. Ved hjælp af et stereotaksisk instrument (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Shenzhen, Kina) og en sprøjte (Hamilton Company, Reno, NV, USA), 0.3 µLof collagenase (0.{{12 }}45 IE; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev infunderet i højrestriatum (AP: +0,2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) med en flowhastighed på 0,1 µL/min.

I alt 0,3 µL saltvand blev infunderet i kontroldyr. Alle kirurgiske procedurer blev udført under aseptiske forhold. I denne undersøgelse blev over 66 hanmus brugt, og dyrene blev tilfældigt tildelt grupper før hvert eksperiment [57].

4.14. Adfærdsanalyse

Den neurologiske adfærdsanalyse af mus efter dannelse af hjernehæmatomer blev detekteret ved test for fjernelse af klæbebånd [61] og cylindertest [60]. Testen til fjernelse af klæbende tapere blev udført ved at placere den klæbende tape på planteområdet på hver forpote (højre og venstre) af musene.

Hver mus blev anbragt i et nyt bur.

Tiden fra båndet blev sat på, til det lykkedes at fjerne musen, blev optaget for hver pote. Der var maksimalt tilladt 300 s for hver pote. Mellem forsøgene blev dyrene anbragt i deres hjemmebure i et patogenfrit anlæg.

Cylindertesten blev udført ved at placere en mus i en transparent akrylglascylinder (diameter: 8 cm; højde: 25 cm) foran 2 spejle og et kamera i 5 min. Kameraet blev placeret centralt foran de 2 spejle og cylinderen for at opnå en optimal video.

Til vurdering af uafhængig brug af forben blev (1) musenes evne til at kontakte cylindervæggen med en forben under fuld opvækst og (2) musenes evne til at lande med kun en forben på gulvet efter fuld opvækst evalueret. Mindst 20 kontaktpunkter for hver forben blev talt ved brug af slowmotion.

Til baseline-analyse før operation blev testen udført to gange pr. mus med en pause på 1 time mellem forsøgene. Forlimbuse udtrykkes som forholdet mellem højre- og venstresidet uafhængig brug af forlemmer.

4.15. Hæmatomvolumenanalyse

For at bestemme, om behandlingerne reducerede hæmatomvolumenet, blev mus aflivet 5 dage efter ICH; hjernerne blev fjernet og flash-frosset i OKT. Koronale snit blev skåret i skiver i en tykkelse på 30 µm og placeret direkte på objektglas. For at kvantificere hæmatomvolumenet blev sektionerne digitaliseret på standardiserede koronale niveauer.

En blindet bruger målte konturerne og hæmatomet i venstre og højre hemisfære i hver sektion. Hæmatomvolumenet og hævelsen blev målt og beregnet ved hjælp af ImageJ (NIH).

Mindst 5 hjerner pr. gruppe blev udsat for hæmatommålinger, og hæmatomvolumenet blev målt i hele hjernen.

4.16. Fluoro-Jade C farvning

Neurodegeneration i mus efter collagenase-induceret ICH blev vurderet ved farvning med et Fluoro-jade C Ready-to-Dilute-farvningskit (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Australien) i henhold til producentens protokol [62].

Kort fortalt blev kontrolmus og ICH-mus (±ip-peptid) aflivet 5 dage efter modellering, og hjernerne blev behandlet i overensstemmelse med protokollen anvendt til immuncytokemi-eksperimentet.

Flydende hjernesektioner blev nedsænket i 1% natriumhydroxidopløsning i 5 minutter, skyllet i 2 minutter i 70% ethanol og derefter skyllet i 2 minutter i destilleret vand. Derefter blev de flydende sektioner nedsænket i en 0,06% kaliumpermanganatopløsning (KMnO4 i destilleret vand) i 10 min.

Sektionerne blev vasket med ddH2O, før de blev nedsænket i 0.0001% Fluoro-jade-farvningsopløsning (Fluoro-jade C i destilleret vand) i 20 minutter under forsigtig rystning i mørket.

Sektionerne blev vasket med ddH2O, monteret på coatede objektglas og tørret ved stuetemperatur natten over i mørke. Fluoro-Jade C-farvning i det perihematomale område blev undersøgt ved hjælp af et Zeiss LSM 880 konfokalmikroskop. Kvantificering af Fluoro-jade C-farvning blev udført ved hjælp af ImageJ-software.

4.17. Vævsimmunfluorescens

Vævsimmunfluorescensfarvning blev udført under anvendelse af en række 30-µm-tykke snit. Sektioner blev inkuberet med følgende primære antistoffer: muse antiNeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, MA, USA) eller muse anti-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, St Louis, MO, USA) antistoffer ved 4 ◦C natten over. Efter vask med PBS blev sektioner derefter inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret æsel-anti-mus (1:1000; Invitrogen, A21202, Carlsbad, CA, USA) antistof.

4.18. TUNEL-analyse

En terminal deoxynucleotidyl transferase-medieret deoxyuridintriphosphat (dUTP) nick end-labeling (TUNEL) assay blev brugt til at identificere apoptotiske celler med nuklear DNAfragmentering i hjernens perihematomale region.

Farvning blev udført ved hjælp af et kommercielt et-trinsTUNEL apoptose assay kit (Beyotime, C1090, Nanjing, Kina) og udført i overensstemmelse med producentens instruktioner. Efter vævsimmunfluorescens blev TUNEL-reaktionen udført.

Hjernesektioner blev inkuberet med en TUNEL-reaktionsblanding (1 time ved 37 ◦C), og derefter blev sektioner vasket med PBS og modfarvet med DAPI. Samlokaliseringen af ​​NeuN-TUNEL-farvning blev undersøgt ved hjælp af et Zeiss LSM 880 konfokalmikroskop.

TUNEL-positive neuroner (NeuN-positive) i den perihematomale region inde i striatum blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software på tre forskellige billeder pr. mus taget under et 20X objektiv. Kolokaliseringen af ​​GFAP-TUNEL-farvning svarede til den af ​​NeuN-TUNEL-farvning.

4.19. In vivo blod-hjernebarriere-permeabilitetsanalyse

In vivo blev blod-hjernebarriere-permeabilitetsassays udført som beskrevet tidligere [63-65]. Kort fortalt blev kontrolmus og ICH-mus (±ip-peptid) intraperitonealt injiceret med FITC-mærket 4 kDa dextran (100 µL 2 mM stamopløsning i PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA) efter modellering 5 dage, efterfulgt af anæstesi 5 minutter senere.

Efter en cirkulationstid på 10 minutter for sporstoffet blev dyrene forberedt til transcardial perfusion, og ~ 300 µl blod blev opsamlet fra brysthulen lige efter atrialpunktur, efterfulgt af perfusion i 3 minutter med PBS. Hemibrain (fri for lugtlapperne, lillehjernen og baghjernen) og en enkelt nyre blev opsamlet og øjeblikkeligt frosset ned i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ◦C.

Til fluorescensmåling blev prøver optøet på is, vejet og homogeniseret i PBS (400 µL for hemicerebrum og 600 µL for nyre), efterfulgt af centrifugering i 20 minutter ved 4 ◦C og 15,000× g.

Supernatanter (100 µL), såvel som lige store volumener af serum (1/5 fortynding i PBS), blev fyldt i en 96-brøndsortplade, og fluorescens blev målt ved den tilsvarende excitation (490 nm)/emission (520 nm) ) i en pladelæser (Tecan, Männedorf, Schweiz). Sham-dyr (uden sporinjektion) blev brugt til at subtrahere autofluorescensværdier. Permeabilitetsindekset (mL/g) blev beregnet som forholdet mellem vævs-RFU'er/g vævsvægt og serum-RFU'er/mL serum.

4,20. Fluorescerende lektinfarvning

For at visualisere hjernemikrokar brugte vi fluorescein-konjugeret Lycopersicon esculentum lectin (1:200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA) til at nedsænke flydende sektioner i 1 time.

Sektioner blev afbildet på et Zeiss LSM 880 konfokalmikroskop under et 20× objektiv, og billeder blev behandlet med en 1,3 gamma indstilling. Tre billeder blev taget fra 3 forudspecificerede områder i det perihematomale område af det koronale hjerne-peranimal. Karforgreningspunkter blev kvantificeret i hver hjerne af en blindet efterforsker. Et forgreningspunkt blev defineret som et enkelt fluorescein-mærket kar, der mærkbart adskilles i 2 distinkte og separate karspor [66].

4.21. Statistisk Analyse

Alle eksperimentelle procedurer blev udført blindet og udført 3 gange uafhængigt som tidligere beskrevet [67]. Data præsenteres som middelværdi ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved envejs ANOVA, tovejs ANOVA og Student's test, alt efter hvad der er relevant, ved brug af GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA ) og SPSS-softwareversion 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

De statistiske parametre kan findes i de relevante figurforklaringer. Statistisk signifikans blev sat til *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; ***p < 0,001; **** p < 0,0001.]

5. Konklusioner

EGF3-domænet for Netrin-1 er afgørende for interaktionen mellem Netrin-1 og DCC og kan aktivere forskellige signalveje. Trunkeret peptid E1 af Netrin-1 (rest 407-422) interagerer med DCC for at beskytte neuroner mod hemin-induceret toksicitet.

Anvendelsen af ​​peptid E1 forbedrer funktionel restitution i en eksperimentel model af ICH. Ydermere kan peptid E1 beskytte neuroner mod degeneration og apoptose efter ICH.

Forfatterbidrag: Conceptualization, LL, Z.-XH og X.-JZ; metodologi, LL, K.-JL og J.-BC; validering H.-LY og X.-XH; undersøgelse, X.-JZ; datakuration, JY; ressourcer LL og Z.-XH; skrive LL, Z.-XH og X.-JZ; supervision, Z.-XH, X.-JZ; funding acquisition, Z.-XHand X.-JZ Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering: Denne forskning blev finansieret af Kinas National Natural Science Foundation (31671065 og 32071018), Science and Technology Development Plan of Jilin Province (202520YY01017404).

Udtalelse fra institutionelle revisionsråd: Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Northeast Normal University (NENU/IACUC, AP2016200299). NationalStandards of the People's Republic of China (GB/T 35892–2018), Laboratory Animal-Guideline for Ethical Review of Animal Welfare, var vejledningen for vores dyrepleje og protokoller.

Erklæring om informeret samtykke: Ikke relevant.

Anerkendelser: Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (31671065 og 32071018) og videnskabs- og teknologiudviklingsplanen i Jilin-provinsen (202520YY01017404).

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter. Finansierne havde ingen rolle i udformningen af ​​undersøgelsen; i indsamling, analyser eller fortolkning af data; i skrivningen af ​​manuskriptet eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.

Referencer

1. Kirshner, HS Medicinsk behandling af intracerebral blødning: Tilbage til det grundlæggende. Int. J. Clin. øv. 2008, 62, 521-522.[CrossRef] [PubMed]

2. Anderson, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Lindley, R.; Robinson, T.; Lavados, P.; Neal, B.; et al. Hurtig blodtrykssænkning hos patienter med akut intracerebral blødning. N. Engl. J. Med. 2013, 368, 2355-2365. [CrossRef][PubMed]

3. Qureshi, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Intracerebral blødning. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]

4. Hold, RF; Hua, Y.; Xi, G. Intracerebral blødning: Mekanismer for skade og terapeutiske mål. Lancet Neurol. 2012, 11.720-731. [CrossRef]

5. Schrag, M.; Kirshner, H. Håndtering af intracerebral blødning: JACC Focus Seminar. J. Am. Saml. Cardiol. 2020, 75, 1819–1831.[CrossRef] [PubMed]

6. Kandasamy, R.; Idris, Z.; Abdullah, JM Kirurgi af intracerebral blødning. I neurovaskulær kirurgi Kirurgiske tilgange til neurovaskulære sygdomme; July, J., Wahjoepramono, EJ, red.; Springer: Singapore, 2019; s. 201-210,7. Broughton,

7. Broughton, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Apoptotiske mekanismer efter cerebral iskæmi. Slagtilfælde 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]

8. Kristiansen, M.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Sonne, O.; Hoffman, HJ; Law, SK; Moestrup, SK Identifikation af hæmoglobin-scavenger-receptoren. Nature 2001, 409, 198–201. [CrossRef]

9. Madangarli, N.; Bonsack, F.; Dasari, R.; Sukumari-Ramesh, S. Intracerebral blødning: Blodkomponenter og neurotoksicitet.Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]

10. Deiner, MS; Kennedy, TE; Fazeli, A.; Serafini, T.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 og DCC medierer aksonvejledning lokalt ved den optiske disk: Tab af funktion fører til optisk nervehypoplasi. Neuron 1997, 19, 575-589. [CrossRef]

11. Kennedy, TE; Serafini, T.; de la Torre, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrins er diffusible kemotrope faktorer for commissural axoner i den embryonale rygmarv. Cell 1994, 78, 425-435. [CrossRef]

12. Flores, C. Rolle af netrin-1 i organiseringen og funktionen af ​​det mesocorticolimbiske dopaminsystem. J. Psychiatry Neurosci. Jpn.2011, 36, 296-310. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com