En ny, ataxisk musemodel af ataksi telangiectasia forårsaget af en klinisk relevant nonsensmutation (del 1)

For mere information kontakt venligstdavid.wan@wecistanche.com

Abstrakt

Ataxia Telangiectasia (AT) og Ataxia with Ocular Apraxia Type 1 (AOA1) er ødelæggende neurologiske lidelser forårsaget af nulmutationer i genomstabilitetsgenerne, henholdsvis AT muteret (ATM) og Aprataxin (APTX). Vores mekanistiske forståelse og terapeutiske repertoire til behandling af disse lidelser er alvorligt mangelfuld, hovedsageligt på grund af, at tidligere dyremodeller med lignende nulmutationer ikke har kunnet rekapitulere det karakteristiske tab af motorisk koordination (dvs. ataksi) og associerede cerebellare defekter. Ved at øgegenotoksiskstress gennem indsættelse af nulmutationer i både Atm (nonsens) og Aptx (knockout) gener i det samme dyr, har vi genereret en ny musemodel, der for første gang udvikler en progressivt alvorlig ataksisk fænotype forbundet med atrofi af cerebellar molekylet lag. Vi finder, at biofysiske egenskaber af cerebellære Purkinje-neuroner er væsentligt forstyrrede (f.eks. reduceret membrankapacitans, lavere aktionspotentiale tærskler osv.), Mens egenskaberne ved synaptiske input stort set forbliver uændrede. Disseforstyrrelsersignifikant ændre Purkinie neuron neurale aktivitet, herunder en progressiv reduktion i spontan aktionspotentiale affyring

den hyppighed, der korrelerer med både cerebellar atrofi og ataksi over dyrets første leveår. Dobbeltmutante mus udviser også en høj disposition for at udvikle cancer (thymomer) og immunabnormiteter (forringet tidlig thymocytudvikling og T-cellemodning), symptomer karakteristiske for AT. Til sidst, ved at indsætte en klinisk relevant nonsens-type nul-mutation i Atm, demonstrerer vi, at Small Molecule Read-Through (SMRT)-forbindelser kan genoprette ATM-produktion, hvilket indikerer deres potentiale som et fremtidigt AT-terapeutisk middel.

Klik her for at lære mere om Cistanche

1.0 Introduktion

Ataxia Telangiectasia (AT) er en sjælden(1 ud af ~100,000)(Swift et al. 1986), en autosomal recessiv genetisk lidelse karakteriseret ved kræftprædisposition, immundefekt og en stærkt penetrerende progressiv og alvorlig ataksi forbundet til cerebellar atrofi (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Boder og Sedgwick 1958; Levy og Lang 2018). AT-patienter dør typisk i deres andet eller tredje årti af livet (Crawford et al. 2006) af lymfekræft, luftvejsinfektioner eller komplikationer af ataksi - desværre har overlevelsesevnen ikke ændret sig dramatisk siden 1950'erne (Micol et al. 2011; Rothblum- Oviatt et al. 2016). Mens sygdomsprogression og dødsårsag varierer meget på tværs af patienter, rapporteres det stærkt penetrerende progressive fald i motorisk koordination at have den største negative indvirkning på en patients livskvalitet (Jackson et al.2016). Behandling er generelt palliativ, rettet mod at reducere, begrænse eller eliminere cancere eller infektioner. Der er ingen langsigtede terapier tilgængelige til behandling af ataksi og tilhørende cerebellar dysfunktion og atrofi. AT er forårsaget af mangel eller dysfunktion af pengeautomaten(AT muteret(Savitsky et al. 1995). Prematur termineringskodon (PTC), der forårsager nonsens-mutationer tegner sig for op til halvdelen af ​​kendte tilfælde, hvor missense- og deletionsmutationer også bidrager (Concannon og Gatti 1997; Sandoval et al. 1999). ATM er en serin/threonin PIKK-familiekinase, der spiller en nøglerolle i DNA-skaderesponset (DDR), der beskytter celler mod titusindvis af DNA-læsioner, der opstår hver dag (Lindahl og Barnes 2000; Kastan og Bartek 2004; Shiloh og Ziv 2013). I den aktive monomere form fosforylerer ATM adskillige nøgleproteiner, hvilket standser produktionen af ​​nyt DNA (cellecyklusstandsning) (Ando et al. 2012), og starter derefter DNA-reparation eller programmeret celle afhængigt af skadens sværhedsgrad. død (dvs. apoptose)(Ando et al.2012; Rashi-Elkeles et al.2006). Adskillige downstream DDR pathway-mål for ATM er blevet identificeret, herunder p53, CHK2, BRCA1, SMC1 og NBS1 (Matsuoka et al.2007). ATM's rolle i DNA-reparation er også impliceret i normal immunsystemudvikling, hvor det foreslås at bidrage til rekombinationen af ​​naturlig DNA-splejsning, der forekommer under genomlejring i T- og B-lymfocytmodning (Chao, Yang og Xu 2000; Matei, Guidos og Danska 2006; Vacchio et al.2007; Schubert, Reichenbach og Zielen 2002 ). Selvom dets roller stadig dukker op, er ATM også blevet impliceret i oxidativ stress-homeostase (Guo et al. 2010) og mitofagi (Valentin-Vega og Kastan 2012; Pizzamiglio, Focchi og Antonucci 2020). Det er uklart, hvorfor ATM-mangel forårsager ataksi, men det er langt fra det eneste DDR-protein, der er forbundet med ataksi, som Aprataxin (APTX) (Aicardi et al.1988), Meiotisk rekombination 11 homolog 1(MRE11)(Sedghi et al.2018), Nibrin (NBS1)(van der Burgt et al.1996), Senataxin (SETX) (Moreira et al.2004) , og Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (TDP1) (Takashima et al. 2002), når de er fraværende eller dysfunktionelle kan forårsage cerebellar-relateret ataksi. Dette tyder på, at de neurologiske træk ved genom-ustabilitetssyndromer har en fælles underliggende årsag, selvom dette endnu ikke er blevet påvist mekanisk (McKinnon 2009; Rass, Ahel og West 2007). En væsentlig faktor, der begrænser vores evne til at definere, hvorfor tabet af DDR-proteiner, som ATM, selektivt påvirker lillehjernen og forårsager progressiv ataksi, er manglen på en dyremodel, der rekapitulerer disse neurologiske symptomer (Lavin 2013). Adskillige AT-gnavermodeller er blevet skabt i løbet af de sidste mange år ved at indsætte genmutationer, der forårsager proteindysfunktion (manglende kinaseaktivitet) eller fuldstændig mangel (Herzog et al. 1998; Xu og Baltimore 1996; Elson et al. 1996; Spring et al. 2001; Campbell et al. 2015; Quek et al. 2016; Tal et al. 2018; Lavin 2013); en minigris blev også for nylig rapporteret (Beraldi et al. 2017). Men ingen udvikler åbenlys, progressiv ataksi med cerebellar dysfunktion og atrofi, der rekapitulerer den menneskelige sygdom, selvom andre aspekter af lidelsen som kræft i skjoldbruskkirtlen, infertilitet og immunabnormiteter udvikler sig. Det er stadig uklart, hvorfor disse tidligere dyremodeller ikke viser den progressive ataksiske fænotype (Lavin 2013). Det er muligt, at artsspecifikke molekylære kompensationer hos mus giver redundanser eller alternative veje, der minimerer virkningerne af ATM-mangel i hjernen (El-Brolosy og Stainier 2017). Det er også muligt, at den forkortede levetid for tidligere modeller (Barlow et al. 1996) er for kort til, at de stokastiske mekanismer, der driver cerebellar dysfunktion og atrofi, kan akkumulere og påvirke motorisk adfærd. Andre udfordringer omfatter potentielt utætte genetiske manipulationer, der resulterer i lave niveauer af ATM-protein eller aktive fragmenter med resterende kinaseaktivitet, hvilket begrænser neuropatologi (Li et al. 2011). Virkningen af ​​at savne en så afgørende dyremodel har

været signifikant, hvilket i høj grad begrænser eksperimentelle undersøgelser fra at identificere de cellulære og molekylære mekanismer og hæmme præklinisk udvikling og afprøvning af hårdt tiltrængte terapier. Vi tester her, om stigende genotoksisk stress, ved at placere nulmutationer i ikke kun Atm-genet, men også det relaterede Aptx-gen, fører til en mere repræsentativ musemodel, der viser cerebellar dysfunktion, atrofi og udvikling af progressiv ataksi. Vi valgte desuden at slå Aptx ud, fordi dens mangel forårsager en AT-lignende lidelse hos mennesker kaldet ataksi med okulær apraksi type 1(AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) i Atm-genet, der er fælles for en stor familie af nordafrikanske AT-patienter (Gilad, Bar-Shira, et al. 1996). Denne mutation resulterer i en prematur termineringskodon (PTC) ved hvad der normalt ville være aminosyre 35 og tab af ATM-translation. Her rapporterer vi proof-of-principle-eksperimenter, der viser, at klinisk relevante genetiske mutationer, der er inkorporeret i AT-musemodellen, er modtagelige for gennemlæsningsforbindelser og dermed egnede til præklinisk testning af SMRT-forbindelser.

2.0 Resultater

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>T-mutation resulterer i forskellige PTC'er i det humane gen sammenlignet med musens Atmgen – TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>T-mutation transformerer glutamin (Q)-kodende CAG-kodon til et TAG-stopkodon og betegnes Atm235×(officielt Atmm1.103c)-tid). Tilstedeværelsen af ​​PTC resulterer i et tab af ATM-ekspression, enten reduceret med ca. halvdelen i heterozygoten, der udtrykker en normal musekopi af

eller Atm Q35v35×) (fig. eller Atm 835×), eller helt i homozygoten (Atm?35×R35×Atm-genet (Atm35× plus 1C).

Atm35x7R35×; Aptx^(dobbelt mutant) mus blev skabt ved først at krydse enkelt mutant AtmF3xR3x (medfødt på C57BL/6J baggrunden) og Aptx'(blandet C57BL/6J og 129 baggrund) mus til Aptx* mus. F1-5 kuldkammerat Atm"; Aptx*-mus blev derefter krydset for at generere heterozygote Atm i kuld for at skabe et tilstrækkeligt antal af de ønskede eksperimentelle og kontrolgenotyper til at bestemme, hvordan tabet af forskellige mængder af ATM og APTX påvirker dyrets fænotype( Fig. 1D).

Ligesom tidligere ATM-mangelfulde AT-musemodeller resulterede ATM- eller APTX-mangel alene ikke i mus med ataksi (video 1 og 2). Mangel på begge proteiner (Atm35k35x; Aptx') resulterer imidlertid i udviklingen af ​​en alvorlig og progressivt ataksisk fænotype (fig. 1E, video 3 og 4).

2.2 ATM-mangelfulde mus har nedsat overlevelsesevne og en høj forekomst af thymomer

Vi vurderede den generelle sundhed og udvikling af kontrol- og eksperimentelle mus, der udtrykte forskellige niveauer af ATM og APTX (fig. 2). Vi fandt ud af, at Atm735xR35×; Aptx^'mus voksede ~55 procent langsommere og nåede estimerede plateauvægte, der var ~35 procent mindre end kontrolgenotyper (log-rang, n=21 til 40,p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0.4 for alle parvise sammenligninger; Fig.2-fig.S1B]. Generelt døde en tredjedel af musene med ATM-mangel af komplikationer relateret til store thymuskræftformer (tymom) fundet i thoraxhulen (fig. 2C). Tilstedeværelsen eller fraværet af APTX påvirkede ikke kræftprævalensen, og mus med mindst én Atm-transskription var kræftfri indtil mindst P400. Samlet set havde ATM, men ikke APTX-mangel, alvorlige virkninger på musenes sundhed og overlevelsesevne.

2.3 Både ATM- og APTX-mangel er nødvendig for at fremkalde progressiv motorisk dysfunktion

Den progressive udvikling af svær ataksi er et kendetegn ved AT, som er rekapituleret i atm? 35/R35x; Aptx' mus, men ingen af ​​de andre kontrolgenotyper, vi testede. Samlet set konstaterer vi, at motoriske koordinationsmangel opstår mellem 210 og 400 dage efter fødslen i Atm735Xk3x; Aptxmus og finder ingen tegn på ataksi hos mus med mindst én kopi af Atm- eller Aptx-genet (fig. 3A, B). For den lodrette poltest, Atm735xR3x×; Aptx' mus tog dobbelt så lang tid at falde ved P400 sammenlignet med Atm*;Aptx*,Atm*; Aptx',Atm735xR35×; Aptx* eller Atm35×*; Aptx' mus [Han:29,1±0,9s(n=3) vs.7,5±0,4s(n=12),12,5±2,5s(n=9),9,2±0,9s (n=10),8,6±0,9s(n=11),1-vej ANOVA,F4.40=19.9,p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 Membran og synaptiske egenskaber er forstyrret i ATM- og APTX-deficiente Purkinje-neuroner

Purkinje-neuroner (PN) er en nøgleneuronal subtype placeret i cerebellar cortex. De udviser betydelig iboende excitabilitet og affyrer aktionspotentialer spontant med hastigheder, der er betydeligt højere end de fleste andre neuroner i hjernen (50 til 100 Hz mere i mange tilfælde). Deres aktivitet former cerebellar output via tonisk hæmning af neuroner i cerebellar kernerne, som projicerer til motoriske koordinationscentre i forhjernen, hjernestammen og rygmarven. Cerebellar PN dysfunktion er forbundet med flere former for ataksi og er impliceret i AT(Hoxha et al.2018: Cook. Fields. og Watt 2021: Shiloh Aptx*-X/R35X.2020). Vi undersøgte derfor, om de elektrofysiologiske egenskaber af PN'er i Atm' cerebellum var unormale. Da PN-baselineaktivitet og responsivitet over for input medieres af et basislinjesæt af passive og aktive membranegenskaber (fig. 4), registrerede og sammenlignede vi direkte membranegenskaberne af PN'er i akutte cerebellare sektioner høstet fra Atm35XR35×; Aptx* og Atm*; Aptx* mus (P350 til 400). PN'er optaget fra Atm35xR35×; Aptx-mus havde betydeligt "strammere" membraner, der viste højere membraninput-modstande (Rm) end dem fra Atm; Aptx* mus [47,7±5,6 (n=15) vs.

30.2±1.47(n=23)MQ, t-test,p-0.008; Fig.4B] og viste en hurtigere membrantidskonstant() [3,6±0,4(n=15) vs.5,1±0,3(n=23)ms, t-test, p=0 .009; Fig. 4B]. Disse resultater indikerer, at den totale membrankapacitans(Cm=t/Rm) af Atm35x/35x;Aptx^PNs er signifikant reduceret [98.25±19.23(n=15) vs.175.6± 12.67(n =23)pF,t-test,p=0.0025;Fig.4B].På cellulært niveau tyder dette på, at de ATM- og APTX-mangelfulde PN'er har mindre (dvs. nedsat areal) eller tyndere membraner

end vildtype-PN'er, et resultat, der tyder på et udviklingsdefekt eller neurodegenerativ proces; Aptx/-and (DellOrco et al.2015). Vi vurderede derefter den iboende excitabilitet af PN'er i AtmR35xR3x;

Atm*;Aptx* mus ved at undersøge PN action potential (AP) generering og dynamik. Signifikante mangler i PN'ers evne til at skyde kontinuerligt som reaktion på strøminjektion blev observeret i Atm?35×3x;Aptx^-mus (fig.4C). Disse underskud var forbundet med betydelige forstyrrelser i amplituden, tærskelværdien og området for fremkaldte aktionspotentialer [amplitude: 66,2± 0.7 (n=14) vs. 72,1±1,4 (n=13)AmV,t-test,p=0.003;tærskel:-55.2±1.5vs.-48. 61±1,9 mV,t-test,p=0.0196; område: 17,96±0,6 vs.

20,63± 1,0 mV*ms, t-test, p=0.048; Fig. 4C]. Tilsammen viser disse eksperimenter betydelige forstyrrelser af PN-fysiologiske egenskaber, der sandsynligvis forstyrrer deres evne til at fungere normalt i lillehjernen af ​​At/mR35×R35×; Aptx' mus.

Vi testede derefter, om ydre og/eller synaptiske PN-egenskaber også blev påvirket i AtmR35xR3sx. Aptx* mus. Vi undersøgte først spontane excitatoriske postsynaptiske strømme (iPSC) genereret af granulcelle-til-PN-synapser (dvs. parallelle fiberinput). Der blev ikke påvist nogen forskel i UPSC-størrelse, hvilket indikerer, at funktionen af ​​granulcelle-axonterminaler (dvs. parallelle fibre) var relativt normal i AtmR35KR35X; Aptx'cerebellum[18,92±1,3(n{{10}})var. 23,4±3,3(n=11)pA,t-test,p=0.477;Fig.4D](Yamasaki, Hashimoto og Kano 20{{5{{58} }}}6). sEPSC-frekvensen viste sig imidlertid at være signifikant øget, et fænomen, der kunne tilskrives enten en stigning i det samlede antal synapser, en stigning i størrelsen af ​​den let frigivelige pulje af synaptiske vesikler eller en stigning i sandsynligheden for neurotransmitter frigivelse i PN'er af fAtmR35XR35X; Aptx'mus [18,75±2,8Hz(n=11) vs. 11,4±1.0Hz(n=11), t-test,p=0.{{ 69}}47; Fig. 4D]. Dernæst undersøgte vi fremkaldt synaptisk frigivelse og kortvarig plasticitet ved samtidig at optage fra PN'er og elektrisk stimulere enten granulcelle (dvs. parallelle fibre) eller inferior olivar (dvs. klatrefiber) axoner med et parret pulsudbrud (2- impulser, 50 ms fra hinanden). De synaptiske egenskaber af parallelle fibre viste sig at være normale og viste ingen signifikante forskelle i den forventede kortsigtede facilitering (Atluri og Regehr 1996) eller halvbredde og henfaldstidskonstant af den fremkaldte EPSC [PPR: 1,3±0. 03 (n=10) vs.1.4±{{90}}.{{1{{1{{106}}5}}1 }}5(n=13),t-test,p=0.162;halvbredde:3.9±0.6 vs.4.9±0.4 ms,t -test,p=0.175;tidskonstant: 3.5±0.5 vs.4.7±0.4 ms,t-test,p=0.054;Fig. 4E]. Til sammenligning fandt vi klatrende fiber-til-PN synaptiske reaktioner, som normalt viser par-puls-depression (Hansel og Linden 2000), t deprimerer i betydeligt større størrelser i Atm/3338/R35X;Aptx'-mus [PPR:0,6±0,03 (n=6)vs.0.7±0.02(n=9),t-test,p=0.03;Fig.4F].Evokens samlede bredde og henfaldstidskonstant strømme var også mindre [halvbredde: 2,3±0,6(n =6).3,0±0,2(n=9)ms,t-test,p=0.004;tidskonstant(hurtig) :1,1±0,14 vs.2,9±0,4ms,t-test, p=0.001]. Selvom disse resultater kan være forårsaget af et præsynaptisk underskud, såsom reducerede vesikellagre i klatrefiber-axonterminalen, er den upåvirkede initiale størrelse af EPSC [2,4±0,4(n=6) vs. 1,9 ±0,2 nA (n=9), t-test, p=0.3] peger på et mere iboende underskud, såsom en reduceret Ca2*-tilstrømning fra det endoplasmatiske retikulum, hvilket kan påvirke langvarigt -term synaptisk plasticitet kritisk for cerebellar funktion (Hoxha et al. 2018; Kano og Watanabe 2017). Samlet set giver forstyrrelserne af de passive og aktive PN-egenskaber, som vi observerer her, sandsynligvis anledning til den betydelige cerebellære dysfunktion i AtmR35X/R35X; Aptx' mus.

2.5 ATM- og APTX-mangel forårsager en progressiv forstyrrelse af PN neural aktivitet, der er forbundet med dendritiskkrympning og generel cerebellar atrofi Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0.3 på tværs af alle parvise sammenligninger; Fig. 4-fig. S3). Tidligere undersøgelser på tværs af flere musemodeller af arvelig ataksi, herunder episodisk ataksi og adskillige varianter af spinocerebellar ataksi, finder, at fysiologisk forstyrrelse i PN-affyring ikke kun ændrer dens frekvens, men også dens regelmæssighed (Kasumu og Bezprozvanny 2012; Jayabal et al. 2016; Stoyas. et al. 2020; Cook, Fields og Watt 2021). Vi sammenlignede både variationskoefficienten (CV) og variabiliteten i tilstødende intervaller (CV2) mellem AtmR35X/R35X; Aptx/ og kontrolmus (fig. 4-fig. S4, S5). Der blev ikke påvist nogen forskel i disse parametre på tværs af køn, alder eller genotype. I overensstemmelse med adfærdsresultaterne blev cerebellar dysfunktion kun fundet i AtmR35XR35X; Aptx'-mus, der udviklede ataksi og ikke i mus med delvis eller fuld ekspression af ATM eller APTX.

2,5 ATM- og APTX-mangel inducerer cerebellar atrofi

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0.3 for alle 4 genotyper ved P460, n=10 til 20]. Desuden fandt vi, at cerebellar størrelse ikke adskilte sig mellem hanner og de i gennemsnit 22 procent mindre hunmus på tværs af genotyper i denne alder [2-way ANOVA, F(2. 153)=1.9, p. =0.2]. Derfor cerebellar neurodegeneration i Atm35XR35×; Aptx*-mus, som begynder efter P120, er korreleret med ATM- og APTX-mangel. Vi fandt cerebellar atrofi at være forbundet med en selektiv reduktion i bredden af ​​det molekylære lag, hvor PN-dendritter opholder sig (fig. 5B). I overensstemmelse med de tidsmæssige ændringer i den store cerebellar størrelse, PN affyringsfrekvens og adfærd, ML bredde i Atm35×R35X; Aptx*-mus var normale hos yngre mus, men faldt gradvist i bredden, efterhånden som sværhedsgraden af ​​ataksi steg 【P400∶120,2±2,1 μm （n=5) mod 140,2±4,8 μm（）,{30} {31}}måde ANOVA,Fu42=45.04,s<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

Kroniske sinopulmonale infektioner forbundet med immundefekt er en af ​​de førende dødsårsager hos AT-patienter (Morrell, Cromartie og Swift 1986; Bhatt og Bush 2014). Immundefekt er forbundet med underskud i genereringen af ​​B- og T-lymfocytter, der er blevet forbundet med defekter i antigenreceptorgenets omlejringsprocesser under genereringen af ​​disse celler i henholdsvis knoglemarven og thymus (Staples et al. 2008). De resulterende defekter i antallet af modne lymfocytter omfatter fald i CD4t-hjælper-T-celler og dræber-CD8*T-celler (Schubert, Reichenbach og Zielen 2002). Vi undersøgte derfor procenterne af T-celler i perifert blod og af forskellige subpopulationer i thymus af Atm35xR35×; Aptx*'-mus ved hjælp af T-celle antigenreceptor (TCR) og CD4/CD8 co-receptor ekspression. I det perifere blod observerede vi en signifikant reduktion i den totale fraktion af CD3*T-celler i mus med reduceret eller fraværende ATM-ekspression sammenlignet med vildtypemus (fig. 6). Denne reduktion blev yderligere forstærket af den samtidige mangel på APTX. ATM- og APTX-mangler reducerede T-celler i perifert blod med over 65 procent sammenlignet med vildtypekontroller. Effekten af ​​APTX-mangel var additiv til virkningen af ​​ATM-mangel, hvilket tyder på en anden virkningsmekanisme for hver af disse to proteiner på T-celle-generering. Reduktionen i procentdelen af ​​T-celler i perifert blod var for det meste forbundet med en reduktion i CD4 plus hjælper T-cellepopulationen (fig. 6B). Af interesse var andelen af ​​CD8 plus T-celler kun forøget i AtmR35X/R35×; Aptx* mus (fig. 6B). Igen observerede vi en differentiel effekt af ATM- og APTX-mangler som set for virkningerne af disse mutationer på den totale T-cel-fraktion. I betragtning af reduktionen i T-cellepopulationer i blodet vurderede vi derefter T-celleudvikling i thymus. I dette organ gennemgår knoglemarvs-afledte T-celle-progenitorer TCR-genomlejring efterfulgt af positiv selektion for MHC-restriktion og negativ selektion af autoreaktive kloner. Faserne af thymocytudvikling kan følges ved at overvåge ekspressionen af ​​CD4- og CD8-ekspression i thymocytter. Progressionen af ​​dette udviklingsprogram går fra dobbelt negative (CD4CD8)thymocytter til dobbeltpositive (CD4*CD8) thymocytter og derefter til enkeltpositive (CD4*eller CD8*)thymocytter. Derudover kan der inden for det dobbeltnegative stadium identificeres fire forskellige subpopulationer baseret på ekspressionen af ​​CD25 og CD44, kendt som DN1(CD44*CD25),DN2 (CD44*CD25*), DN3 (CD44 CD25*) og DN4 (CD44 grader CD25) (Germain 2002). Genomlejring under thymocytudvikling forekommer to gange - én gang på det dobbelt negative thymocytstadium i CD25*CD44-stadiet (Krangel 2009) og derefter igen i det dobbeltpositive thymocytstadium, før det udvikler sig til separate CD4*- og CD8t-enkelt positive populationer (Livak et al. . 1999). ATM-mangel er blevet forbundet med defekter i begge omlejringsanfald hos mus (Vachio 2007, Hathcock 2013). Derfor sammenlignede vi andelen af ​​celler i thymus, der udtrykker disse forskellige udviklingscelleoverflademarkører i vores ATM-deficiente og kontrolmus (fig. 7). AtmR35xR35×; Aptx og Atm35×; Aptx^ men ikke AtmR35XR35; Aptx*-mus havde signifikant forhøjede andele af CD44*CD25-, CD44*CD25t- og CD44CD25*-celler sammenlignet med vildtype(fig. 7A). Disse øgede andele synes delvist at skyldes en hindring af CD44CD25t-celler, der modnes til CD44CD25-dobbeltnegative celler, som fraktionen af ​​CD44CD25-celler fra Atm735xR35x; Aptx'og Atm35× plus ; Aptx'-mus er signifikant lavere end vildtype (fig. 7A). Af interesse havde APTX-mangel i sig selv den største effekt på tabet af DN4-celler, hvilket tyder på, at APTX-mangel snarere end ATM-mangel er ansvarlig for denne effekt. Så vidt vi ved, implicerer dette fund for første gang APTX i genomlejring under processen med TCR-rekombination. Dernæst så vi på proportionerne af CD4*CD8t-thymocytter sammenlignet med CD4tCD8 og CD4CD8 plus enkeltpositive thymocytter i disse fire forskellige stammer. I overensstemmelse med vores resultater i blodet og tidligere undersøgelser fandt vi, at ATM-mangelfulde mus, men ikke kontrolmus, udviste nedsat ekspression af CD4*CD8 og CD4CD8* enkelte positive thymocytter (fig. 7B). Disse resultater understøtter rollen af ​​ATM i TCR a/δ-genomlejring under thymocytudvikling (Bredemeyer et al.2006), en rolle, der er uafhængig af den rolle, som APTX spiller i tidlig thymocytmodning.

2.7 Gennemlæsningsmolekyler overvinder PTC for at genoprette ATM-ekspression

Vores primære begrundelse for at indsætte en klinisk relevant nonsens-mutation i Atm-genet var at generere en mus, der var modtagelig for kritisk præ-klinisk test af et nyt sæt SMRT-forbindelser. Vi har tidligere vist, at SMRT-forbindelser genvinder produktionen af ​​ATM-protein i AT-patientafledte lymfoblastoide cellelinjer ved at overvinde premature termineringskodoner (PTC) forårsaget af nonsensmutationer (Du et al. 2013). For at demonstrere egnetheden af ​​denne nye AT-dyremodel til SMRT-forbindelsestestning valgte vi direkte at undersøge deres evne til at genoprette ATM-ekspression ved hjælp af en eksplantattilgang, der omgår udfordringer relateret til in vivo-levering (f.eks. biotilgængelighed, leveringsvej osv.). ATM-ekspression blev målt i prøver fra milten, hvor ATM normalt udtrykkes ved høje niveauer, og cerebellum, et nøglemålvæv for lidelsen. Udsatte vi disse eksplantationsvæv, høstet fra homozygote Atm?35× og Atm? 35 mus med enten en kandidat-SMRT-forbindelse (GJ103) eller et aminoglykosid, der tidligere er kendt for at have gennemlæsningsegenskaber (G418) og målte derefter ATM-ekspression ved immunoblot for at vurdere restaurering. I begge typer af ATM-deficiente mus blev ATM-ekspression konsekvent genoprettet i milten og cerebellum af både G418 og GJ103 (fig. 8). Disse resultater viser, at vores SMRT-forbindelser kan muliggøre gennemlæsning af mindst 2 af de 3 mulige nonsens-mutationer, der forårsager PTC'er, og giver begrundelsen for in vivo-effektivitetstestning i opfølgende undersøgelser.