En netværksfarmakologisk undersøgelse af Hypericum Japonicums molekylære mekanismer i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis med validering i en alfa-naphthylisothiocyanat (ANIT) hepatotoksicitetsrottemodel

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Baggrund: Denne netværksfarmakologiske undersøgelse havde til formål at identificere de aktive forbindelser og molekylære mekanismer involveret i virkningerne af Hypericum japonicum på kolestatisk hepatitis. Vi validerede resultaterne i en alfa-naphthyl-isothiocyanat (ANIT) rottemodel for hepatotoksicitet.

Materiale/metoder: De kemiske bestanddele og mål af H.japonicum og målgener, der tidligere var forbundet med kolestatisk hepatitis, blev hentet fra offentlige databaser. Et netværk blev konstrueret ved hjælp af Cytoscape 3.7.2-software, og STRING-databasen og potentielle proteinfunktioner blev analyseret baseret på den offentlige platform for bio-informatik. ANIT blev brugt til at inducere kolestatisk hepatitis i en rottemodel med 36 Sprague-Dawley rotter, og denne model blev brugt til at undersøge intervention med 3 doser afquercetin(lav dosis, 50 mg/kg; middel dosis, 100 mg/kg; og høj dosis, 200 mg/kg), den vigtigste aktive komponent i H.japonicum. Niveauer af biokemiske serumindekser blev målt med kommercielle sæt, og messenger RNA (mRNA) niveauerne af markører for lever- og mitokondriefunktion ogoxidativt stressblev detekteret ved revers transkription-polymerase-kædereaktion i realtid (RT-PCR).

Resultater: De vigtigste aktive ingredienser i H. japonicum var quercetin, kaempferol og tetra methoxy luteolin. og deres nøglemål inkluderede prostaglandin G/H-syntase 2(PTGS2), B-cellelymfom-2 (BCL2), kolesterol7-alfa-hydroxylase (CYP7A1) og farnesoid X-receptor (FXR). Quercetin-intervention fremmede bedring fra kolestatisk hepatitis.

Resultaterne fra denne forskning giver støtte til fremtidig forskning i rollerne af quercetin, kaempferol og

Konklusioner: tetra methoxy luteolin i human leversygdom og rollerne af PTGS2, BCL2, CYP7A1 og FXR generne i kolestatisk hepatitis.

Nøgleord: Kolestase, intrahepatisk· genregulerende netværk ·Hypericum·medicin, traditionel kinesisk·farmakologi· Quercetin

Baggrund

Kolestaseer et klinisk syndrom, der involverer leverlæsioner forårsaget af unormal galdedannelse, sekretion og udskillelse. Kolestatiske leversygdomme er tæt forbundet med forstyrrelser i galdesyresyntese og -transport og forårsager hyppigt kolestatisk leverskade, som i sidste ende kan udvikle sig til leverfibrose, cirrhose og leversvigt [1,2].

Kolestase er en af ​​hovedårsagerne til kolestatisk hepatitis og alfa-naphthylisothiocyanat (ANIT)-induceret kolestase og kan i sidste ende resultere i kolestatisk hepatitis. ANIT er et kemisk toksin, der bruges til at inducere hepatocellulær nekrose, galdegangshyperplasi og leverfibrose, som bruges til at producere en leverskade eller kolestatisk hepatitis i dyreforsøgsmodeller. I forskningsundersøgelser injiceres rotter intraperitonealt med ANIT for at replikere kolestatisk hepatitis [3-5]. De histopatologiske træk ved leverskade under kolestase involverer levervævsnekrose, proliferation af galdekanaler, hydropiske ændringer,betændelseog fibrose. ANIT-induceret kolestase hos dyr udviser signifikant stigning i plasmabiomarkører for leverskade, såsom alaninaminotransferase (ALD), aspartataminotransferase (AST), alkalisk phosphatase og y-glutamin-yltranspeptidase (y-GGT).Oxidativt stresser også signifikant øget, hvilket fremgår af høje niveauer af reaktive oxygenarter, lipidperoxidation, udtømte glutathionreservoirer og nedsat vævsantioxidantkapacitet i leveren. Endnu vigtigere viser ANIT-inducerede dyr hæmning af mitokondriel dehydrogenaseaktivitet, et kollaps af mitokondrielt membranpotentiale og mitokondriel hævelse. Mitokondrier fra ANIT-inducerede kolestatiske rotter udviser øget modtagelighed for mitokondriel permeabilitetsovergang poreåbning og nedsat repolarisering af ATPase-aktivitet. Følgelig er kolestatisk hepatitis tæt forbundet med leverfunktion, oxidativt stress og mitokondriers struktur og funktioner [6,7].

På nuværende tidspunkt anvendes kun få lægemidler, såsom ursodeoxycholsyre (UCDA), til behandling afkolestase[8,9]; men disse lægemidler har ulemper, herunder dårlig respons, bivirkninger og lav compliance. Traditionel kinesisk medicin har dog en lang historie og rig klinisk erfaring med behandling af leversygdomme, såsom intrahepatisk kolestase. Hypericum japonicum er det tørrede hele græs af Hypericum japonicum Thunb. ex Murray, også kendt som Di-er-Cao eller Tian-ji-Huang, er blevet brugt til behandling af gulsot siden Qing-dynastiet. H. japonicum har funktionerne at fjerne varme, fjerne fugt, berolige leveren og forbedre galdeblæren og er almindeligt anvendt i den kliniske behandling af fugtig-varme gulsot [10]. Den kemiske sammensætning af H. japonicum omfatter flavonoider, lanthanoider, chromonglycosider, phloroglucinolderivater og lactoner. Blandt flavonoiderne er quercitrin, isoquercitrin og quercetin-7-O- -l-rhamnoside ingredienserne med hepatobeskyttende aktivitet [11]. Ning Wang et al demonstrerede, at de vandige ekstrakter af H.japonicum, herunder quercetin, iso-quercetin og quercetin, har en antihepatotoksisk og anti-kolestase-effekt på kultetrachlorid-induceret hepatitis og ANIT-induceret kolestase-forsøgsdyr [12]. Imidlertid er mekanismerne og målene for H. japonicum i behandlingen af ​​intrahepatisk kolestase stadig uklare.

I denne undersøgelse blev netværksfarmakologi og farmakologiske eksperimenter kombineret. Først blev de vigtigste aktive komponenter og mål af H.japonicum identificeret i silico og brugt til at konstruere et komponent-mål-netværk[13,14]. Funktionelle berigelsesanalyser af målgener blev udført for at udforske mulige terapeutiske mekanismer i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis. Derefter blev en rottemodel af kolestatisk hepatitis induceret af ANIT brugt til at afsløre de mekanismer, der ligger til grund for virkningerne af H.japonicum i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis og dens beskyttende virkning på leveren. Specifikt undersøgte vi mitokondrielt membranpotentiale, hepatocytapoptose, regulering af intrahepatisk galdesyrehomeostase og andre veje.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

H. japonicum Thunb. ex Murray blev købt fra Kangmei Pharmaceutical Co., Ltd. (Puning, Kina); -naphthylisothiocyanat (ANIT, 98 procent) blev købt fra Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. (Shanghai, Kina);quercetin(>98.0%)and ursodeoxycholic acid (UCDA,>98 procent) blev købt fra Dalian Melone Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, Kina). Olivenolie blev købt fra Sigma Aldrich Trading Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Malondialdehyd (MDA), superoxiddismutase (SOD), direkte bilirubin (DBI), total bilirubin (TBIL), total galdesyre (TBA), ALT og AST assay kits og glutathionperoxidase (GSH-Px) kits blev købt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). Bio-Rad DC-proteinassay-reagenspakken blev købt fra Bio-Rad Laboratories (CA, USA). HyPure molekylærbiologisk vand, FastStart Universal SYBR Green Master mix (Rox) og RevertAid First Strand cDNA-syntesesæt blev købt fra Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Primerne mod PTGS2, B-cellelymfom-2(BCL2), kolesterol 7-alfahydroxylase (CYP7A1), farnesoid X-receptor (FXR), interleukin-1 beta(L{{ 13}}B), og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-o) blev købt fra Service bio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Kina). Alle andre kemikalier og reagenser var af analytisk kvalitet eller højere og blev købt fra kommercielle kilder.

Dyr

Sprague-Dawley-hanrotter, der vejede 180 g til 220 g, blev købt fra Center for Experimental Animals ved Southam Medical University (SCXK(YUE)2018-0085). Rotterne blev anbragt i bure med mad og vand tilvejebragt ad libitum og akklimatiseret til laboratoriet i 1 uge før hvert forsøg. Alle procedurer, der involverer dyr og pleje, blev godkendt af udvalget for brug af mennesker og dyr i undervisnings- og forskningsafdelingen på Guangzhou University of Medicine. Dyrets certificeringsnummer var 44002100016560.

Screening af komponenter og mål af H.japonicum

Ved at bruge "Di-er-cao" som søgeordet søgte vi efter de kemiske ingredienser og relaterede mål af H.japonicum i Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology-databasen, som er en værdifuld platform for systemfarmakologisk forskning af kinesisk urtemedicin og en database over netværksrelationer mellem lægemidler, mål og sygdomme [15]. Gennavnene, der svarer til målene, blev opnået ved hjælp af UniPort Knowledgebase, et centralt knudepunkt for indsamling af funktionel information om proteiner[16]. Organismen blev udvalgt som "menneske".

Terapeutisk målforudsigelse og netværkskonstruktion

"Cholestatic hepatitis" blev brugt som nøgleordet til at opnå proteinmål og tilsvarende gennavne for kolestatisk hepatitis i GeneCards database, som automatisk miner og integrerer menneskelig gen-centreret information fra utallige datakilder [17]. Mål med "gaver 230" blev udvalgt som terapeutiske mål for kolestatisk hepatitis. For at opnå de potentielle mål for H.japonicum til behandling af kolestatisk hepatitis, blev lægemiddelmålene og sygdomsmålene gennemskåret i henhold til "gennavnet". Cytoscape 3.7.2-software [18] blev brugt til at konstruere komponent-mål-netværket, og netværksanalysatorfunktionen blev brugt til at analysere netværkstopologiparametrene.

Målproteininteraktionsanalyse

Skæringsmålene for H.japonicum og kolestatisk hepatitis blev importeret til String-databasen, som kan afsløre direkte (fysiske) og indirekte (funktionelle) protein-protein-interaktioner (PPI) [19]. Med høj sikkerhed (0.9) som screeningsbetingelse, fjernelse af de isolerede mål og definering af arten som menneske, blev der oprettet et PPI-netværk. Efter import af ovenstående data til Cytoscape blev analysemetoden Maximal Clique Centrality (MCC) i cytoHubba plug-in brugt til at analysere de vigtigste regulatoriske mål for PPI-netværket

Målfunktion og baneberigelsesanalyse

For yderligere at forstå de biologiske processer og signalveje for målproteingener blev målene til behandling af kolestatisk hepatitis af H. japonicum indlæst i Metascape, et kraftfuldt genannoteringsanalyseværktøj[20]. Arten var begrænset til mennesker, og P<0.01 was="" set="" as="" the="" significance="" threshold.="" gene="" ontology="" (go)="" functional="" annotation="" and="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" (kegg)pathway="" enrichment="" analyses="" were="" carried="" out,="" and="" the="" first="" 20="" cluster="" analysis="" results="" were="" drawn="" into="" a="" bar="" chart="" for="" visual="" processing="" using="" the="" omicshare="" tools,="" a="" free="" online="" platform="" for="" data="" analysis="" and="" detailed="" implementation="" process,="" as="" shown="" in="" figure="">

Terapeutiske virkninger af Quercetin på ANIT-induceret kolestatisk hepatitis hos rotter

Seksogtredive Sprague-Dawley hanrotter blev tilfældigt opdelt i 6 grupper (n=6 pr. gruppe): Gruppen modtog lokalt blank vehikel i 7 dage og ip-injektion af olivenolie (2 ml/kg kropsvægt) på dag 5 ; Gruppe ll modtog oralt blank vehikel i 7 dage; Gruppe II blev behandlet oralt med UCDA (50 mg/kg legemsvægt) i 7 dage; Gruppe V blev behandlet oralt med højdosis quercetin (Que H; 200 mg/kg legemsvægt) i 7 dage; Gruppe V blev behandlet oralt med middeldosis quercetin (QueM; 100 mg/kg kropsvægt) i 7 dage; og gruppe VI blev behandlet oralt med lavdosis quercetin (Quel, 50 mg/kg legemsvægt) i 7 dage. Rotterne i gruppe Il-VIl fik administreret ANIT-olivenolieopløsning (100 mg/kg, ip, 2 ml/kg kropsvægt) 2 timer efter administration af UCDA eller quercetin på dag 5. Model- og kontrolgrupperne blev behandlet oralt med et blankt opløsningsmiddel dagligt [21,22].

48 timer efter den sidste administration af ANIT blev dyrene aflivet ved bedøvelse via ip-injektion (100 mg/kg pentobarbital). Blod blev opsamlet fra abdominal aorta til biokemisk evaluering. Leveren blev straks fjernet og vejet. En stor del af leveren blev lynfrosset i flydende nitrogen, og det resterende væv blev fikseret i 4 procent paraformaldehyd, behandlet og indlejret i paraffin til histologisk undersøgelse efter hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning. Leverskade blev evalueret baseret på niveauerne af ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA og andy-GGT under anvendelse af en Chemray 240 Automatic Biochemical Analyzer (Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Kina). Niveauerne af MDA, GSH-Px og SOD blev evalueret ved hjælp af kommercielle kits i henhold til producentens instruktioner, og histologisk vurdering og scoring blev udført i henhold til standardiserede kriterier af en patolog, der var blindet for undersøgelsen. Til real-time revers transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analyse blev levervæv hurtigt frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 grad indtil analyse.

Analyse af PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, Il-1 og TNF-mRNA'er ved RT-PCR

totalt RNA blev ekstraheret fra levervæv ved anvendelse af TRlzol i henhold til producentens instruktioner (Service bio, Wuhan, Kina). Total RNA（10 μLl） blev omvendt transskriberet til cDNA.PCR-reaktioner (20 ul) for GAPDH, PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, TNF- og IL-1 indeholdt 2 μL cDNA ,2μL 2,5 μMprimer, 10μLgPCR-blanding og 6 μL ddH,O. Reaktionerne blev inkuberet ved 65 grader i 10 minutter, derefter ved 42 grader i 60 minutter og afsluttet ved 72 grader i 15 minutter. PCR-primersekvenserne er anført i tabel 1. RT-PCR-reaktioner blev udført som følger: et præcyklisk trin ved 95 grader C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser af denaturisering ved 95 grader C i 30 sekunder og annealing ved 60 grader C. i 60 s. Smeltekurven var fra 65 grader til 95 grader med en rampehastighed på 0,3 grader C/15 s. Fluorescens blev målt ved slutningen af ​​hvert annealingstrin, og smeltekurverne blev overvåget for at bekræfte specificiteten af ​​PCR-produkterne. 2-一CT-metoden blev brugt til at bestemme mRNA-ekspressionsniveauerne for PTGS2,BCL2,CYP7A1, FXR,IL-1B og TNF-mRNA'er i forhold til kontrolgenet GAPDH.

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 8.

3.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Dataene blev analyseret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Dunnett's test.P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Resultater

Komponenter og mål af H.japonicum

For fuldt ud at undersøge komponenterne i H. japonicum satte vi ikke de farmakokinetiske parametre, såsom oral biotilgængelighed og lægemiddel-lignhed, som screeningskriterier. Gennem TCMSP-databasen blev 49 aktive komponenter og 499 tilsvarende mål af H. japonicum opnået. Efter at have fjernet dubletter og rettet navne af Uniprot, blev 269 mål bibeholdt. De aktive komponenter af H.japonicum og parameteroplysningerne er vist i tabel 2.

Mål for H.japonicum i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis

I GeneCards database blev 682 mål for kolestatisk hepatitis screenet. Endelig blev 93 mål, der kan være relateret til H. japonicum-behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis, opnået ved at krydse målene for aktive komponenter og sygdom (figur 2).

Sammensat-mål netværk

Komponent-mål-netværket af H. japonicum i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis bestod af 115 noder og 175 kanter, hvor 22 sekskantede noder repræsenterede aktive komponenter og 93 V-formede noder repræsenterede mål (figur 3).

Størrelsen og gennemsigtigheden af ​​noderne blev indstillet efter grad. Jo højere gradværdi, jo større knudepunkt, og jo mørkere farve, jo større tilslutning og vigtighed. Som vist i resultaterne havde H. japonicum multi-komponent og multi-target handling; dvs. 1 forbindelse, der interagerer med flere mål, og forskellige forbindelser, der interagerer med det samme mål. Ifølge netværkstopologiparametrene, såsom grad, mellemhed og nærhed, var de vigtigste aktive komponenter quercetin, kaempferol og tet-ramethoxyluteolin (tabel 3), og kernemålene var PTGS2, nitrogenoxidsyntase (NOS3), peroxisom proliferativ aktiveret receptor gamma (PPARG), dipeptidylpeptidase V(DPP4), BCL2 og TNF (tabel 4).

PPI netværk

Interaktionen mellem 93 intersektionsmål for lægemidler og sygdom blev analyseret ved hjælp af STRING-databasen. Høj konfidens (0.9) blev sat, isolerede mål blev skjult, og et PPI-netværk med 81 mål og 299 interaktionslinks blev opnået (figur 4A). Ved at anvende MCC-algoritmen for cytoHubba var de 10 øverste regulatoriske mål i PPI-netværket TNF, IL6, IL1B, CXCL8, IL10, CCL2, ICAM1, NFKB1, NFKBIA og MYC (Figur 4B).

Målfunktion og baneberigelse

GO funktionelle annotering og KEGG pathway berigelse analyser af terapeutiske mål blev udført ved hjælp af Metascape.I alt 1899 GO elementer blev opnået, herunder 41 elementer for cellesammensætning, 105 elementer for molekylær funktion og 1753 elementer for biologisk proces. De vigtigste biologiske processer og cellulære komponenter, hvori H. japonicum var involveret, omfattede responser på lipopolysaccharid, cytokin-medieret signalering, apoptotisk signalering, membranflåde (Figur 5A, 5B) og molekylære funktioner, herunder cytokinreceptorbinding, transkriptionsfaktorbinding og serin -type endopeptidaseaktivitet (figur 5C). I alt blev 146 KEGG-signalveje analyseret, hvor de mest bemærkelsesværdige var AGE-RAGE- og TNF-signalvejene og hepatitis B, argininbiosyntese og galdesekretion. (Figur 5D).

Quercetin beskyttet mod ANIT-induceret kolestatisk hepatitis hos rotter

I den intrahepatiske kolestase-rottemodel genoprettede quercetin lever/kropsvægt-forholdet ved leverskade med kolestase (figur 6). Serum ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA og Y-GGT, som blev brugt til at evaluere intrahepatisk galdegangsproliferation og kolestase forbundet med levercelleskade, blev drastisk forøget i modelrotterne. I modsætning hertil reducerede quercetin dosisafhængigt serum ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA og GGT niveauer. På samme måde forbedrede quercetinbehandling ANIT-induceret leveroxidativt stress, øgede serum SOD og GSH-Px niveauer og reducerede MDA niveauer (figur 7).

Histologiske evalueringer ved H&E-farvning gav direkte bevis for de forebyggende og terapeutiske virkninger af quercetin på ANIT-induceret intrahepatisk kolestase. H&E-farvning viste, at levervævet i kontrolgruppen udviste en normal mikrostruktur, de hepatiske lobuler var klare, og levercellekablet var pænt og velordnet uden unormale morfologiske ændringer. I modsætning hertil viste ANIT-behandlede leversektioner utydelig leverlobustruktur, forstyrrelse af leverstrengen, hepatisk hævelse, hyperæmi og nekrose (figur 8A). Imidlertid svækkede quercetin signifikant graden af ​​hepatisk forrådnelse og inflammatorisk celleinfiltration, hvilket viste et dosis-effekt forhold. Disse resultater afslørede, at quercetin beskyttede mod ANIT-induceret leverskade, der stammer fra intrahepatisk kolestase hos rotter.

Quercetin-beskyttet PTGS2-, BCL2-, CYP7A1-, FXR I-1B- og TNF-mRNA-ekspression

For yderligere at evaluere den beskyttende effekt af quercetin på hepatocytter i ANIT-inducerede intrahepatiske kolestatiske leverskaderotter blev mRNA-niveauerne af PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1 og TNF- målt ved hjælp af RT-PCR. Som vist i figur 8B, sammenlignet med kontrolmus, blev PTGS2, CYP7A1, IL-1 og TNF- opreguleret i ANIT-modelgruppen, men BCL2 og FXR blev nedreguleret. Dog administration af quercetin (ved doser på 50.100 og 200 mg/kg) og UCDA

signifikant reduceret ekspressionen af ​​PTGS2, CYP7A1, IL-1 og TNF-mRNA med 44,4 procent (P<><><0.05), and=""><0.05), respectively,="" and="" increased="" the="" expression="" of="" bcl2="" and="" fxr="" mrna="" by="" 92.9%="" and=""><0.01), respectively,="" was="" the="" anit="" model="" group.="" these="" results="" showed="" that="" quercetin="" could="" protect="" hepatocytes="" by="" accelerating="" the="" excretion="" and="" transport="" of="" bile="" acids,="" maintaining="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" of="" hepatocytes,="" and="" inhibiting="">

Diskussion

Tilsammen brugte vi en ANIT-induceret rottemodel, som viste, at H.japonicum kan være en behandling af kolestatisk hepatitis. Netværksfarmakologi og farmakodynamiske eksperimenter belyste virkningen og den molekylære mekanisme af H. japonicum i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis og gav et teoretisk grundlag for yderligere forskning og klinisk anvendelse af urten.

De vigtigste kemiske bestanddele af H. japonicum er blandt andet flavonoider [23], phloroglucinolderivater og dipeptider [11]. Puthur et al. bestemte, at IC50 af H.japon-icum acetonekstrakter på ascitesceller er 29,30 ug/ml, hvor deres resultater viser en god antitumoraktivitet in vitro, og at de methanoliske ekstrakter af H.japonicum har en synergistisk effekt på skadedyr ved hæmning af nogle nøgleenzymer. Deres eksperimenter afslørede, at H. japonicum har forskellige biologiske aktiviteter, der kræver yderligere undersøgelse [24,25]. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at ekstraktet af H. ja-ponicum har en række biologiske aktiviteter, herunder hepa-tobeskyttende, antioxidativ,anti-inflammatorisk, og antitumoreffekter.H.japonicum og dets hovedkomponenter beskytter mod kultetrachlorid-induceret hepatitis, ANIT-induceret cholesta-sis og anti-duck hepatitis A viral aktivitet og forbedrer leverfunktion og oxidativ skade[12,26]. Isoquercitrin og quer-cetin 7-rhamnoside er de vigtigste aktive leverbeskyttende ingredienser [11,27]. Den nuværende undersøgelse viste, at quercetin, hovedbestanddelen af ​​H.japonicum, kan reducere ANIT-induceret hepatocytdegeneration og nekrose og reducere graden af ​​leverskade. H&E-resultater bekræftede yderligere den beskyttende effekt af quercetin på kolestatisk hepatitis.

I denne undersøgelse kombinerede vi netværksfarmakologisk forskning med farmakologiske dyreforsøg. Først screenede vi de vigtigste aktive komponenter og mål af H. japonicum i behandlingen af ​​kolestatisk hepatitis. Vi konstruerede derefter et "komponent-mål" netværk og analyserede den funktionelle berigelse af målene for at udforske den mulige mekanisme for dets terapeutiske virkning mod kolestatisk hepatitis. Endelig verificerede vi disse mål og molekylære mekanismer gennem dyreforsøg. De biokemiske indekser og patologiske karakteristika ved intrahepatisk kolestase, som vi observerede, var i overensstemmelse med menneskelige sygdomme, hvilket understøtter den kliniske relevans af vores rottemodel for kolestatisk hepatitis.

Serumniveauet af galdesyre anses for at være afgørende bevis for den kliniske diagnose af intrahepatiske kolestaseforstyrrelser og deres resulterende leverskade. Intrahepatisk kolestase fører til obstruktion af normal udskillelse af galde og leverfunktion

enzymer, hvilket resulterede i en stigning i serum TBIL, DBIL og TBA, og vi viste, at quercetin reverserede ANIT-induceret galdesyre dysregulering. Derudover reducerede quercetin signifikant serumniveauerne af AST, ALT og y-GGT, som blev dramatisk øget på grund af degeneration og nekrose af hepatocytter og hepatocytmembranskade.

Lipidperoxidation er en af ​​de vigtige patologiske mekanismer ved ANIT-induceret kolestatisk hepatitis, der forårsager levercelleskade |28-30]. Niveauet af oxidativt stress i kroppen afspejler sværhedsgraden af ​​kolestatisk hepatitis, hvorfor GSH-Px, SOD og MDA, der bruges til at vurdere lipidperoxidniveauer, er vigtige indikatorer. I denne undersøgelse viste hver quercetin-doseringsgruppe signifikant reduceret MDA med øgede SOD- og GSH-Px-aktiviteter. Disse resultater indikerede, at lindring af levercelleskade ved quercetin var forbundet med frie radikaler, hæmning af lipidperoxidation og reduktion af produktionen af ​​lipidperoxider.

Netværksfarmakologiske resultater indikerede, at de vigtigste relevante mål for behandling af kolestatisk hepatitis af H. japonicum inkluderer PTGS2, NOS3, PPARG, DPP4, BCL2 og TNF. I den nuværende undersøgelse, 5 mål, PTGS2, BCL2, TNF-, FXR og CYP7A1. som er forbundet med kolestatisk hepatitis, leverfibrose og leverskader, blev udvalgt til forskning på molekylært niveau. PTGS2, også kendt som cyclooxygenase 2, er et nedstrøms molekyle af NF-KB-vejen [31,32]. PTGS2 deltager i forekomsten af ​​inflammation ved at fremme celleproliferation, hæmme celleapoptose, fremme angiogenese og hæmme immunfunktionen. TNF- er en vigtig inflammatorisk mediator, der deltager i processen med kolestase. I vores undersøgelse blev ekspressionsniveauerne for PTGS2, TNF-protein og mRNA opreguleret i levervævene hos de ANIT-inducerede kolestatiske leverskademodelrotter, hvilket tyder på, at PTGS2-overekspression kan fremme akut leverskade og udvikling af kolestase.

BCL2 er et protein, der hæmmer celleapoptose. Det forhindrer oxidativ skade og DNA-fragmentering af cellekomponenter og regulerer antioxidative veje [33]. Det forbedrer også mitokondriemembranpotentialet og hæmmer den mitokondrielle frigivelse af cytochrom C og apoptose-inducerende faktorer ved at påvirke cellemembrantransporten og derved inhibere levercelleapoptose og andre effekter [34,35].

FXR er en galdesyrereceptor, der regulerer homøostasen af ​​galdesyre i leveren [36]. Det hæmmer aktiviteten af ​​det hastighedsbegrænsende galdesyresyntese-enzym CYP7A1 gennem negativ feedback-regulering medieret af en lille heterodimer chaperon og reducerer syntesen af ​​galdesyre. Samtidig kan FXR opregulere ekspressionen af ​​transportørerne BSEP og MRP2 på sidemembranen af ​​hepatocytgaldekanalen, hvilket accelererer udskillelsen og transporten af ​​galdesyrer for at beskytte leverceller [37,38].

Vores resultater viste, at modelrotter har en stor mængde cholsyrestase under påvirkning af ANIT, hvilket fører til nedregulering af FXR-ekspression og en deraf følgende stigning i CYP7A1-ekspression. Den nedregulerede ekspression af FXR forårsagede også et fald i ekspressionen af ​​downstream-generne BSEP og MRP2, som det regulerer. Quercetin-intervention genoprettede signifikant ekspressionsniveauet af FXR i rottelevervæv og regulerede ekspressionen af ​​dets nedstrøms gener CYP7A1, BSEP og MRP2 i den modsatte retning af modelgruppen. Resultaterne af denne undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere forskningskonklusioner.

ANIT-induceret kolestatisk hepatitis har biokemiske og patologiske ændringer, der ligner menneskers. Imidlertid var den patologiske proces af den enkelte ANIT-behandling kort i denne undersøgelse, hvilket begrænsede den forskning, der normalt kræver en længere eksperimentel periode på 48 til 72 timer. Multipel intermitterende administration af ANIT vil overvinde denne ulempe. Netværksfarmakologi af traditionel kinesisk medicin tager de kemiske sammensætninger, der findes i medicinske materialer, som forskningsobjekt; dog er de kemiske stoffer involveret i lægemiddeleffektiviteten af ​​traditionel kinesisk medicin ikke nødvendigvis en enkelt komponent, fordi det effektive stof kan være en gruppe af farmakodynamiske komponenter. Fordi målene og veje for stoffer i traditionel kinesisk medicin normalt er kendt, er der begrænsninger for opdagelsen af ​​nye mekanismer. I fremtiden kan kunstig intelligens algoritmer kombineres med netværksfarmakologi for at opnå mere omfattende og objektiv information.

Konklusioner

Sammenfattende kan H. japonicum ved hjælp af aktive ingredienser såsom quercetin aktivere FXR, hæmme CYP7A1, reducere syntesen af ​​galdesyre i hepatocytter og øge den ekstrahepatiske udskillelse af galdesyre. Det kan også regulere BCL2 for at forbedre mitokondrielt membranpotentiale, hæmme hepatocytapoptose og regulere homeostasen af ​​galdesyre i leveren. Ved at hæmme ekspressionen af ​​PTGS2, IL-1 og TNF- kan det endvidere interferere med det inflammatoriske respons. Kort sagt, ifølge netværksfarmakologianalysen er quercetin, kaempferol og tetramethoxy luteolin de vigtigste aktive ingredienser i H. japonicum til lindring af kolestatisk hepatitis. Resultaterne af denne undersøgelse kan give støtte til fremtidig forskning i rollen af ​​quercetin, kaempferol og tetra-methoxyluteolin i human leversygdom og rollerne af PTGS2, BCL2, CYP7A1 og FXR gener i kolestatisk hepatitis.