En homozygot dab1−// er en potentiel ny årsag til autosomale recessive medfødte anomalier i musens nyre og urinveje

edmund.chen@wecistanche.com

Introduktion

Yotari-mutantmus, opnået ved spontan erhvervelse af en mutation i Dab1-genet, udviser histologiske abnormiteter i centralnervesystemet [1,2], meget lig dem af reeler (reelin//) mus, hvilket tyder på, at reelin og DAB1 tilhører den samme signalvej [1-4]. Afvigelserne i reelin/DAB1-vejen er blevet rapporteret at være forbundet med forskellige psykiatriske lidelser [5-7]. Det er interessant, at udover centralnervesystemet er tilstedeværelsen af ​​DAB1- og reelin-proteiner også blevet bekræftet i det perifere nervesystem og nogle ekstraneurale væv. Tilstedeværelsen af ​​DAB1 er blevet fundet i musepodocytter [8] og humane fosternyrer[9] mens reelin-ekspression er blevet rapporteret under muse- og menneskeføtal udvikling, såvel som i nogle endotelceller langs blodkar i den voksne mus [9-11]. Den kanoniske reelin/DAB1-vej kan udløse forskellige downstream-proteiner, herunder NOTCH2-receptorer, som spiller en afgørende rolle i celleskæbnebeslutninger og differentiering undernyreudvikling [12-14]. NOTCH2-receptorer er nødvendige for at danne proksimale tubuli og podocytter [13], men når nefronmodning er opnået, er denne vej for det meste dæmpet [15]. Under akutte tilstandenyresygdomme,øget ekspression af NOTCH2 kan potentielt bidrage til regenerering, mens vedvarende ekspression er kausalt forbundet med interstitiel fifibrose og glomerulosklerose [15]. Nedregulering af NOTCH-signalering kan i høj grad mindske autofagi og forårsage podocytdifferentieringsforringelse under udvikling [16].

Følgelig spiller dysfunktionelle podocytter en afgørende rolle i glomerulær sygdom, især i humant idiopatisk nefrotisk syndrom [17,18] og i minimal forandring nefrotisk syndrom (MCNS) [19]. Derfor opretholder autofagi cellulær homeostase under normale fysiologiske forhold, hvorimod den under patologiske tilstande kan udvikle sig til autofagisk død [20]. En udbredt autophagy biomarkør er LC3B, et strukturelt protein af autophagosomale membraner [21]. Kompleks krydstale mellem autofagi og apoptose bidrager også til opretholdelsen af ​​homøostatisk balance som en reaktion på cellens mikromiljø. Det er velkendt, at apoptotiske begivenheder stiger i antal i løbet afnyreudvikling [22] og aftager meget, når modningen er forbi, undtagen i forhold tilnyreskade[23]. Unægtelig er apoptose en kompleks mekanisme reguleret gennem samspillet mellem flere veje, men afsluttes for det meste med aktivering af caspase3 (CASP3), hvis aktivering er en af ​​de mest brugte markører til apoptosedetektion [23].

I denne rapport havde vi til formål at analysere, hvordan Dab1-genets funktionelle lyddæmpning påvirkernyremorfologi og ekspression og lokalisering af reelin, NOTCH2, LC3B og spaltede CASP3-proteiner i postnatale musnyrer. Vi antager, at disse proteiner er udtrykt i den postnatale musnyre,og deres funktionelle samspil bidrager til opretholdelsen af ​​deres struktur og funktion. Desuden, da tilstedeværelsen af ​​DAB1 er blevet bekræftet under føtal humannyreudvikling [9], kunne det antages, at dets inaktivering kan forårsage uorden i et bredt spektrum af medfødte anomalier inyreog urinveje (CAKUT).

Nøgleord:yotari; nyrefunktion; postnatal nyreudvikling; immunfluorescensfarvning; transmissionselektronmikroskopi

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKTIONEN

Materialer og metoder

Samling af prøverSom Dab1 null konventionelle mutanter brugte vi yotari (Dab1/) mus, som tidligere er beskrevet af Howell et al. [24]. PCR-primere anvendt til genotypebestemmelse af musene var yotari: GCC CTTCAGCATCACCATGCT og CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, vildtype af Dab1-locus: GCCCTTCAGCATCACCATGCT og CCTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. C57BL/6 N-mus blev opdrættet og gruppeopstaldet i standard polycarbonatbure (inklusive mindst én af hver genotype) med ad libitum adgang til mad og vand i et temperaturkontrolleret (23 ± 2 ◦C) rum med et 12 timers lys/ mørk cyklus. På postnatale dag 4, 11 og 14 (P4, P11 og P14) blev mus dybt bedøvet med pentobarbital og transkardialt perfunderet i 1 0 min med phosphatbuffer saltvand (PBS, pH 7,2) og 4 procent paraformaldehyd (PFA) ) i 0,1 M PBS.Nyrerblev fjernet og fikseret med 4 procent PFA i 0,1 M PBS natten over til konventionelle histologiske analyser (hæmatoxylin-eosin (H&E), immunhistokemisk og immunfluorescensfarvning) og i en 2 procent PFA plus 2,5 procent glutaraldehyd (GA) blanding til elektronmikroskopundersøgelse. Efter fifiksering blev væv forberedt til yderligere histologisk undersøgelse, som vi tidligere har beskrevet [25,26].

Immunofluorescens og immunoperoxidasefarvningEfter deparafifinisering og rehydrering blev sektioner opvarmet i 20 minutter i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i en vanddamper og efterfølgende afkølet til stuetemperatur. Blokeringsbuffer (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) blev påført i 30 minutter for at udelukke uspecifik farvning. Sektioner blev derefter inkuberet i et fugtighedskammer natten over med primære antistoffer (tabel 1). Efter vask i PBS blev sekundære antistoffer (tabel 1) påført i en time og vasket i PBS igen. Derefter blev kerner farvet med 4060 -diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 2 minutter, vasket i PBS og dækglas. Vi udførte præadsorptionstesten, således at hvert primært antistof blev brugt med det tilsvarende peptid og påførte deres kombination til sektionerne. Resultaterne viste ingen antistoffarvning. Derudover blev der udført kontroller med udeladelse af det primære antistof til bestemmelse af niveauer af ikke-specifik binding af sekundære antistoffer.

Til immunoperoxidasefarvning blev kanin polyklonalt anti-CASP3 (1:100 fortyndinger, ab13847, Abcam, Cambridge, UK) påført som et primært antistof i en time i et fugtkammer efter behandlingen af ​​snittet med 0,1 procent H2O2. Efter vask i PBS blev sekundær detektion udført under anvendelse af koblingen og streptavidinperoxidase, hver i femten minutter (DakoCytomation, CA 93013 USA, LOT 03477) og diaminobenzidin (Dako, CA 93013 USA, LOT 10051369), kontrolleret omhyggeligt for at undgå baggrund. Kerner blev farvet med hæmatoxylin, skyllet i postevand i 10 minutter, kortvarigt dehydreret i stigende serier af ethanolopløsninger og dækglas.

Vævsforberedelse til transmissionselektronmikroskop (TEM)Efter fiksering med en blanding af 2 procent PFA og 2,5 procent GA i 0,1 M PBS i 2 timer, blev prøverne vasket med PBS og efterfikseret i en vandig opløsning af 2 procent osmiumtetroxid i 2 timer. Alle prøver blev vasket to gange i PBS, dehydreret i stigende kvaliteter af ethanol og indlejret i Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Seriesnit (70 nm i tykkelse) blev skåret på en Ultracut UCT ultramikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) og farvet med 1 procent uranylacetat og blycitrat.

Dataindsamling og analyseAnalysen blev udført med et epiflfluorescensmikroskop (Olympus BX51, Tokyo, Japan) udstyret med et DP71 digitalkamera (Olympus), et JEM 1400 transmissionselektronmikroskop (JEOL, Tokyo, Japan) opereret ved 80 kV og fotograferet med en JEOL ladning- koblet enhed (CCD) kamerasystem (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA, USA) og endelig et lys-fifield mikroskop (BX40, Olympus, Tokyo, Japan). Alle analyserede billeder blev behandlet med ImageJ-software og Adobe Photoshop (Adobe, San Jose, CA, USA). Per undersøgt gruppe brugte vi tre til fire dyr. Alt samletnyrerblev skåret i 5 µm tykke snit og maksimumnyre length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, hvilket indikerer fremragende overensstemmelse [27].

Statistisk analyseEn to-halet t-test blev udført for at analysere forskellene i den gennemsnitlige diameter mellem PCT, DCT og G af vildtype- og yotari-dyr. Diameteren blev præsenteret som middel ± standardafvigelse (SD). Signifikansniveauet blev sat til p < 0.05.="" en="" tovejs="" anova-test="" efterfulgt="" af="" tukeys="" multiple="" sammenligningstest="" blev="" brugt="" til="" at="" undersøge="" forskellene="" i="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" mellem="" pct,="" dct="" og="" glomeruli="" på="" alle="" tidspunkter.="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" blev="" udtrykt="" som="" middelværdien="" ±="" standardfejl="" af="" middelværdien="" (sem).="" signifikansniveauet="" blev="" sat="" til="" p="">< 0,05.="" analysen="" blev="" udført="" i="" graphpad="" software="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

Resultater

Hæmatoxylin-Eosin-farvning (H&E) og måling af nyrediameterH&E-farvning af midsagittale sektioner afnyrerpå alle undersøgte tidspunkter fremhæver det lillenyrefænotype af yotari-mus sammenlignet med vildtype (figur 1a). Ved 4P gennemsnitnyrediameteren af ​​yotari-dyr var omkring 55 µm end omkring 75 µm. Derudover var denne forskel mærkbar på senere tidspunkter på grund af den langsommere vækst afnyreri yotari sammenlignet med den progressive vækst afnyrerhos vildtype dyr. For at afgøre, om reduktionen i samletnyrestørrelsen var forårsaget af et fald i nefronsegmentstørrelsen, gennemsnittet vi diameteren af ​​PCT, DCT og G pr. gruppe. Faktisk var der et fald i middeldiameter G, PCT og DCT i yotari-gruppen sammenlignet med vildtype (figur 1b, p < 0.05).="" derudover="" afslørede="" h&e-farvning="" tyndere="" cortex="">nyrebækkenforlængelse hos yotari-dyr og let diffust dilateret DCT ved 14P. Den grundlæggende struktur og mønster af glomerulær modning er den samme i begge undersøgte dyregrupper.

Deskriptiv histologisk analyse baseret på TEM-mikrofotografierPå mikrofotografier opnået ved TEM viste glomeruli fra vildtype mus det typiske udseende af alle dele af fifiltreringsbarrieren, som normalt var udviklet og genkendelige (figur 2a). Podocytter, podocyt-fodprocesser og pedikler, fifiltrationsspalter, glomerulære basalmembraner og kapillærlumen med det fenestrerede endotel var let at skelne (figur 2a). På den anden side, i glomeruli af yotari-mus, kunne progressiv podocytbeskadigelse med udslettelse af fodprocessen og mangel på fifiltrationsspalter observeres (figur 2b-d). Disse ultrastrukturelle ændringer blev observeret i allenyrerundersøgte og involverede de fleste af de undersøgte glomeruli. Ingen abnormiteter blev bemærket i PCT eller DCT af yotari mus end vildtype dyr (figur 2e-h). I PCT blev cellegrænseflader dårligt defineret på grund af uregelmæssigheden af ​​cellemembraner og celleinterdigitation med deres naboer. Cytoplasmaet var rigeligt og indeholdt velkendte kerner, aflange mitokondrier, basale udfoldninger og mange rørformede gruber mellem mikrovilli, som dannede en børstekant ved den apikale membran. Større forstørrelse afslørede den apikale overflade af PCT-epitelceller indeholdende lange mikrovilli for at danne børstekanten og tætte forbindelser mellem de luminale cellegrænser af naborørformede epitelceller (figur 2e,f). På den anden side indeholdt den apikale overflade af DCT-epitelceller få korte mikrovilli og talrige vesikler (figur 2g, h).

Figur 2. Transmissionselektronmikroskop (TEM) mikrofotografier af vildtype og yotarinyrer.Glomeruli fra vildtypedyr (a) viste en normalt udviklet fifiltreringsbarriere med fenestreret endotel (E) i kapillæren (C), basalmembran (BM), podocytter (P) med pedikler (PE) og fifiltreringsspalter (FS). ). I dennyreraf yotari-dyr kunne udslettelse af pediklerne og mangel på fifiltrationsspalter bemærkes (stjerner, b–d). Der blev ikke bemærket abnormiteter i de proksimale snoede tubuli (PCT) eller distale convoluted tubuli (DCT) af yotari-mus sammenlignet med vildtypedyrene (e–h). I PCT var cytoplasmaet rigeligt og indeholdt velkendte kerner (N), aflange mitokondrier (M), basale udfoldninger (BI) og mange rørformede fordybninger (TP) mellem mikrovilli, som dannede en børstekant (BB) ved apikale membran (e,f). Højere forstørrelse afslørede den apikale overflade af PCT-epitelceller indeholdende lange mikrovilli for at danne børstekanten og tætte forbindelser (TJ) mellem de luminale cellegrænser af naborørformede epitelceller (e,f). På den anden side indeholder den apikale overflade af DCT-epitelceller få korte mikrovilli og talrige vesikler (g,h). Skalalinjen i billeder (a–d) og indsættelser (e–h) er 1 µm; skalaen i billeder (e–h) er 2 µm.

Lokalisering og samlokalisering af Reelin og DAB1Reelin blev svagt udtrykt med mild til moderat reaktivitet (tabel 2) i glomeruli og DCT hos alle undersøgte dyr på alle observerede tidspunkter (p < 0.05,="" figur="" 3a).="" kun="" i="" pct="" af="" yotari="" mus="" var="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" signifikant="" højere="" end="" vildtype="" dyr="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3a).="" i="" de="" glomerulære="" celler="" var="" lokaliseringen="" af="" ​​farvning="" perinukleær,="" mens="" den="" i="" pct="" og="" dct="" var="" spredt="" ud="" over="" cytoplasmaet="" (figur="">

figur 4. Immunfluorescensfarvning af postnatal yotarinyrermed reelin-markør (a) og dobbelt immunfluorescensfarvning af postnatal vildtypenyrermed DAB1 og reelin markører (b). (a,b) Nuklear DNA DAPI-farvning fusionerede med DAB1, og reelin-immunfluorescens vises parallelt (fusion). Observerede tidspunkter var P4, P11, P14. Ekspression af de undersøgte markører i glomeruli (G), proximale convoluted tubuli (PCT) og distale convoluted tubuli (DCT) er markeret med pilene, mens asterisker indikerer ekspression af reelin i den ekstracellulære matrix (a). Indsæt viser det mest fremtrædende udtryk i billedet. DAPI nuklear farvning afslørede dårlig kolokalisering af DAB1 og reelin, for det meste i DCT (pilespids). Målestok er 20 µm og henviser til alle billeder.

Der var næsten ingen immunreaktivitet af DAB1 i glomeruli og PCT fra vildtypedyr ved P4, mens procentdelen af ​​positive celler med mild reaktivitet (tabel 2) steg signifikant ved P11 og P14 (p < 0.05,="" figur="" 3b).="" i="" dct="" blev="" dab1="" for="" det="" meste="" udtrykt="" ved="" de="" apikale="" og="" laterale="" dele="" af="" cellemembraner="" (figur="" 4b)="" med="" stærk="" reaktivitet="" (tabel="" 2).="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" var="" signifikant="" højere="" end="" i="" tidligere="" strukturer,="" omkring="" 60="" procent="" (figur="" 3b),="" især="" i="" macula="" densa="" (figur="" 4b).="" der="" var="" næsten="" ingen="" kolokalisering="" af="" dab1="" og="" reelin="" undtagen="" i="" dct="" af="" vildtypedyr="" ved="" p14="" (pilespids,="" figur="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" af="" 14="" figur="" 4.="" immunoflfluorescensfarvning="" af="" postnatal="">nyrermed reelin-markør (a) og dobbelt immunfluorescensfarvning af postnatal vildtypenyrermed DAB1 og reelin markører (b). (a,b) Nuklear DNA DAPI-farvning fusionerede med DAB1, og reelin-immunofluorescens vises parallelt (fusion). Observerede tidspunkter var P4, P11, P14. Ekspression af de undersøgte markører i glomeruli (G), proximale convoluted tubuli (PCT) og distale convoluted tubuli (DCT) er markeret med pilene, mens asterisker indikerer ekspression af reelin i den ekstracellulære matrix (a). Indsæt viser det mest fremtrædende udtryk i billedet. DAPI nuklear farvning afslørede dårlig kolokalisering af DAB1 og reelin, for det meste i DCT (pilespids). Målestok er 20 µm og henviser til alle billeder. Der var næsten ingen immunreaktivitet af DAB1 i glomeruli og PCT fra vildtypedyr ved P4, mens procentdelen af ​​positive celler med mild reaktivitet (tabel 2) steg signifikant ved P11 og P14 (p < 0,05,="" figur="" 3b).="" i="" dct="" blev="" dab1="" for="" det="" meste="" udtrykt="" ved="" de="" apikale="" og="" laterale="" dele="" af="" cellemembraner="" (figur="" 4b)="" med="" stærk="" reaktivitet="" (tabel="" 2).="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" var="" signifikant="" højere="" end="" i="" tidligere="" strukturer,="" omkring="" 60="" procent="" (figur="" 3b),="" især="" i="" gule="" flekker="" (figur="" 4b).="" der="" var="" næsten="" ingen="" kolokalisering="" af="" dab1="" og="" reelin="" undtagen="" i="" dct="" af="" vildtype="" dyr="" ved="" p14="" (pilespids,="" figur="">

Rumlige og tidsmæssige udtryksmønstre af NOTCH2 og LC3BProcentdelen af ​​NOTCH{0}}positive celler var mindre end 20 procent i glomeruli af begge dyregenotyper på alle observerede tidspunkter. Kun ved P14 var procentdelen af ​​positive celler signifikant højere i glomeruli hos yotari-dyr end vildtypedyr (p < 0,05,="" figur="" 3c).="" farvningsintensiteten="" var="" mild="" til="" moderat="" (tabel="" 2),="" for="" det="" meste="" lokaliseret="" perinukleært="" (figur="" 5a-f).="" i="" pct="" og="" dct="" for="" begge="" dyregenotyper="" steg="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" over="" tid.="" ved="" p14="" var="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" signifikant="" højere="" i="" pct="" og="" dct="" af="" yotari="" dyr="" end="" pct="" og="" dct="" af="" vildtype="" dyr="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3c).="" signalintensiteten="" på="" alle="" observerede="" tidspunkter="" var="" mild="" til="" moderat="" (tabel="" 2)="" og="" spredt="" over="" hele="" cytoplasmaet="" (figur="" 5a-f).="" figur="" 5.="" immunfluorescensfarvning="" af="" postnatal="" vildtype="" og="">nyrermed NOTCH2 og LC3B markører og immunoperoxidase farvning med spaltet caspase3 (CASP3) markør. (a–f) Nuklear DNA DAPI-farvning fusioneres med NOTCH2 og LC3B. Observerede tidspunkter var P4, P11, P14. Ekspression af NOTCH2- og LC3B-markørerne i glomeruli (G), proksimale convoluted tubuli (PCT) og distale convoluted tubuli (DCT) er markeret med pilene. Særlig stærk LC3B-reaktivitet kan observeres i Bowman-kapslen af ​​henfaldende glomeruli (stjerne, e). Indsæt viser det mest fremtrædende udtryk i billedet. CASP3 var dårligt udtrykt i alle observerede tidspunkter. Det eneste signifikante udtryk var i glomeruli af yotari-mus på P14 (pile). Målestok er 20 µm og refererer til alle billeder. Biomolekyler 2021, 11, 609 9 af 14 3.4. Rumlige og temporale ekspressionsmønstre af NOTCH2 og LC3B Procentdelen af ​​NOTCH2-positive celler var mindre end 20 procent i glomeruli af begge dyregenotyper på alle observerede tidspunkter. Kun ved P14 var procentdelen af ​​positive celler signifikant højere i glomeruli hos yotari-dyr end vildtypedyr (p < 0,05,="" figur="" 3c).="" farvningsintensiteten="" var="" mild="" til="" moderat="" (tabel="" 2),="" for="" det="" meste="" lokaliseret="" perinukleært="" (figur="" 5a-f).="" i="" pct="" og="" dct="" for="" begge="" dyregenotyper="" steg="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" over="" tid.="" ved="" p14="" var="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" signifikant="" højere="" i="" pct="" og="" dct="" hos="" yotari-dyr="" end="" pct="" og="" dct="" hos="" vildtypedyr="" (p="">< 0,05,="" figur="" 3c).="" signalintensiteten="" på="" alle="" observerede="" tidspunkter="" var="" mild="" til="" moderat="" (tabel="" 2)="" og="" spredt="" over="" hele="" cytoplasmaet="" (figur="">

Figur 5. Immunfluorescensfarvning af postnatal vildtype og yotarinyrermed NOTCH2 og LC3B markører og immunoperoxidase farvning med spaltet caspase3 (CASP3) markør. (a–f) Nuklear DNA DAPI-farvning fusioneres med NOTCH2 og LC3B. Observerede tidspunkter var P4, P11, P14. Ekspression af NOTCH2- og LC3B-markørerne i glomeruli (G), proksimale convoluted tubuli (PCT) og distale convoluted tubuli (DCT) er markeret med pilene. Særlig stærk LC3B-reaktivitet kan observeres i Bowman-kapslen af ​​henfaldende glomeruli (stjerne, e). Indsæt viser det mest fremtrædende udtryk i billedet. CASP3 var dårligt udtrykt i alle observerede tidspunkter. Det eneste signifikante udtryk var i glomeruli af yotari-mus på P14 (pile). Målestok er 20 µm og henviser til alle billeder.

I glomeruli og DCT af begge dyregenotyper steg procentdelen af ​​LC3B-positive celler over tid (p < 0.05,="" figur="" 3d).="" ved="" p11="" og="" p14="" var="" procentdelen="" af="" ​​positive="" celler="" signifikant="" højere="" i="" glomeruli="" hos="" yotari-dyr="" end="" glomeruli="" hos="" vildtypedyr="" (p="">< 0.05,="" figur="" 3d).="" i="" glomeruli="" hos="" yotari-dyr="" var="" farvningsintensiteten="" for="" det="" meste="" moderat="" til="" stærk="" (tabel="" 2)="" lokaliseret="" i="" det="" perinukleare="" og="" nukleare="" rum="" (figur="" 5a–f),="" på="" alle="" observerede="" tidspunkter,="" mens="" intensiteten="" i="" glomeruli="" hos="" vildtypemus="" var="" for="" det="" meste="" moderat="" (tabel="" 2).="" pct="" af="" yotari-="" og="" vildtypedyr="" indeholdt="" omkring="" 20="" procent="" af="" positive="" celler="" på="" alle="" observerede="" tidspunkter="" (p="">< 0,05,="" figur="">

Spaltet CASP-3-udtrykDer var næsten intet udtryk for den aktiverede CASP-3 inyreraf vildtypedyr på alle observerede tidspunkter. I PCT og DCT af yotari mus var flere individuelle celler CASP -3-positive (figur 3e). Kun i glomeruli af yotari nyrer ved P14 (figur 5e) steg procentdelen af ​​positive celler signifikant ift.nyreraf vildtype mus (p < 0.05, figur 3e).

Diskussion

Nyremorfogenese og udvikling er komplekse processer, der præcist koordineres gennem samspillet mellem en lang række gener. Medfødte anomalier afnyreog urinveje (CAKUT) er den mest almindelige fødselsdefekt, der udgør 23 procent af alle sådanne defekter og repræsenterer den førende årsag til slutstadietnyresygdomhos børn [28,29]. Enkeltgenforstyrrelser kan være den primære kilde til CAKUT, og indtil nu er en mutation i mere end 20 gener blevet identificeret som årsagen til CAKUT [30]. Som vores tidligere arbejde viste stor ekspression af DAB1 under normale føtale menneskernyreudvikling [9], antog vi, at DAB1 kunne spille en væsentlig rolle under pattedyrnyreudvikling. For at bevise vores hypotese undersøgte vinyremorfologi og ekspressionsmønstre af reelin, NOTCH2, LC3B og aktiverede CASP3-proteiner i Dab1 knockout-mus.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESMERTER

Sektion gennem yotari-musenenyrerafslørede en tyndere cortex og et væsentligt mindre gennemsnitnyreog PCT, DCT og G diametre sammenlignet med vildtype dyr. Faldet inyrestørrelse forårsaget af utilstrækkelig nefronbegavelse er kendt somnyrehypoplasi, en af ​​de mest almindelige CAKUT-lidelser, som disponerer hypertension hos voksne og kronisk nyresygdom [31]. Derudover afslørede mikrofotografierne taget med TEM, at yotari-mus udviste fremtrædende podocytbeskadigelse med udslettelse af fodprocessen og mangel på fifiltreringsspalter. Efter skaden gennemgår podocytter udslettelsesprocessen, hvor de mister deres struktur, hvilket fører til en reduktion i deres fifiltrationsbarrierefunktion [32]. Alle former for nefrotisk syndrom, såvel som fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), er karakteriseret ved defekter i podocytstruktur eller funktion [33].

Vores nuværende undersøgelse viste den højeste ekspression af DAB1 ved de apikale og laterale dele af cellemembraner af DCT, mens REELIN for det meste var spredt ud over cytoplasmaet af PCT. På de undersøgte tidspunkter blev der ikke observeret nogen morfologiske ændringer i tubuli af yotari-mus, men yderligere undersøgelse er nødvendig for at belyse rollen af ​​DAB1 i tubulointerstitielle rum. Der var lejlighedsvis kolokalisering af DAB1- og REELIN-proteinerne, for det meste i DCT. Disse resultater følger vores tidligere arbejde vedrørende ekspressionen af ​​disse to proteiner under føtalt menneskenyreudvikling [9]. Dette kan tyde på, at DAB1 og reelin har lignende roller hos mennesker og musnyrerved at aktivere nogle af de nedstrøms veje, såsom Crk, MAPK og PI3K/Akt/mTOR signaleringskaskader [34-36]. Vores data afslørede også øget reelin-ekspression i glomeruli af yotari-mus. Interessant nok har en tidligere undersøgelse vist, at DAB1-phosphorylering og øget reelin-ekspression i glomeruli er ledsaget af hypertension, proteinuri og podocyt-skade i Ang II-infunderede rotter [10].

Derudover afslørede immunfluorescensfarvning en øget ekspression af NOTCH2-receptorer i glomeruli af P14 yotari-mus. Det er velkendt, at NOTCH2-ekspression nedreguleres, når nefronmodningen er opnået, undtagen under betingelserne fornyreskader,såsom diabetisk nefropati og FSGS [15,37]. Mus med det Adriamycin-inducerede nefrotisk syndrom viste også øget ekspression af aktiveret NOTCH2, som forbedrer fifibrose [38]. På de undersøgte tidspunkter bemærkede vi ikke øget fifibrose, men det er tilbage at belyse den nøjagtige rolle af den udtrykte NOTCH2 i den postnatale yotarinyrer.Yderligere observation af, om fifibrotiske ændringer forekommer i de senere stadier, ville være nødvendig. Der er dog allerede nogle fifund, der tyder på, at den kortsigtede effekt af øget NOTCH2-aktivering er forbundet med en stærk overlevelsesfordel for beskadigede podocytter, som går tabt i langsigtede modeller, såsom diabetisk nefropati [39].

Højere LC3B-ekspression i glomeruli af P11- og P14-yotari-mus afspejlede sandsynligvis en akkumulering af autofagosomer i podocytterne. For tydeligt at vise, at autofagi blev accelereret. Det er nødvendigt at analysere forholdet mellem LC3-II og LC3-I proteinekspressioner. Under normale forhold er autofagi nødvendig for normalnyrefunktion[40], især i podocytter. På grund af dens begrænsede kapacitet til celledeling og -erstatning udviser de et højt basalt niveau af autofagi [41]. På trods af disse resultater er stigning i LC3B-ekspression blevet rapporteret i adskillige glomerulære sygdomme [42-44], hovedsageligt i forbindelse med udslettelse af fodprocessen og udvikling af nefrotisk syndrom, som det ses hos proreninreceptor-betingede knockout-mus [45,46]. Alle disse undersøgelser tyder på en beskyttende rolle af øget autofagi under patologiske tilstande, yderligere understøttet af fifindingerne af Adriamycin-induceret nefropati, hvor autofagi aktiveres for at beskytte mod podocytskade [43], såvel som i aldersafhængig glomerulær sygdom, hvor den forsinker den progressive funktionelle tilbagegang afnyrefunktion[40]. Analyse af mennesketnyreBiopsier viste også tegn på øget autofagi i forbindelse med udslettelse af fodprocessen i flere glomerulære sygdomme, herunder minimal change nefrotisk syndrom (MCNS), som er en af ​​de mest almindelige årsager til idiopatisk nefrotisk syndrom [19]. I tilstande af diabetisk nefropati og lipopolysaccharid-induceret akutnyreskade,forstærkning af autofagi med nogle terapeutiske midler gennem hæmning af PI3K/AKT/mTOR-vejen forbedrer nyrefunktionen [47,48]. Alle disse fund implicerer, at autofagi har en uundværlig cytobeskyttende rolle for stresstilpasning inyreskade, og dets modulering kan være en lovende terapeutisk strategi, selvom autofagi under nogle omstændigheder også kan være skadelig og udvikle sig til celledød.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESVIGT

Bortset fra stigningen i autofagi, kunne et øget niveau af apoptose også observeres i glomeruli af P14 yotari mus. Autofagi forhindrer normalt apoptose, men under specifikke patologiske omstændigheder kan det også have en modsat effekt på celleoverlevelse ved at forstærke og fremme apoptose [42]. Efter fødslen, apoptose inyrerer stærkt formindsket, undtagen i forhold tilnyreskade,såsom idiopatisk nefrotisk syndrom, hvor bidrager til at udvikle sygdommen [23]. potentiel ny årsag til autosomale recessive medfødte anomaliernyreog urinveje. Men hovedrollen af ​​DAB1 undernyreudviklingen er stadig uklar. Derudover udviste disse mus fodprocesabnormiteter og et øget niveau af reelin, NOTCH2, LC3B og spaltede CASP3-proteiner i glomeruli, der kan føre til glomerulære skader, såsom nefrotisk syndrom, som i sammenhæng med hypoplasi kan være en potentiel dødsårsag af disse dyr i fravænningsperioden. For at bekræfte denne hypotese er det nødvendigt at give yderligere oplysninger om blodtryk og andre klinik-laboratorieparametre, såsom niveauer af serumkreatinin, albumin og proteiner.