Abstrakt:Quercetin er blevet grundigt undersøgt for dets anti-Alzheimers sygdom (AD) og anti-aging virkninger. Vores tidligere undersøgelser har fundet ud af, at quercetin og i dets glycosidform, rutin, kan modulere proteasomfunktionen i neuroblastomceller. Vi havde til formål at udforske virkningerne af quercetin og rutin på intracellulær redox-homeostase i hjernen (reduceret glutathion/oxideret glutathion, GSH/GSSG), dets korrelation med -site APP spaltende enzym 1 (BACE1) aktivitet og amyloid precursor protein (APP) ekspression i transgene TgAPP-mus (bærende human svensk mutation APP transgen, APPswe). På grundlag af, at BACE1-protein- og APP-behandling er reguleret af ubiquitin-proteasom-vejen, og at tilskud med GSH beskytter neuroner mod proteasomhæmning, undersøgte vi, om en diæt indeholdende quercetin eller rutin (30 mg/kg/dag, 4 uger) mindsker adskillige tidlige tegn på AD. Genotypeanalyser af dyr blev udført ved PCR. For at bestemme intracellulær redox-homeostase blev spektrofluorometriske metoder anvendt til at kvantificere GSH- og GSSG-niveauer ved hjælp af o-phthalaldehyd, og GSH/GSSG-forholdet blev konstateret. Niveauer af TBARS blev bestemt som en markør for lipidperoxidation. Enzymaktiviteter af SOD, CAT, GR og GPx blev bestemt i cortex og hippocampus. BACE1-aktivitet blev målt ved et sekretasespecifikt substrat konjugeret til to reportermolekyler (EDANS og DABCYL). Genekspression af de vigtigste antioxidantenzymer: APP, BACE1, et Disintegrin- og metalloproteinasedomæneholdigt protein 10 (ADAM10), caspase-3, caspase-6 og inflammatoriske cytokiner blev bestemt ved RT-PCR. For det første reducerede overekspression af APPswe i TgAPP-mus GSH/GSSG-forholdet, øgede malonaldehyd (MDA) niveauer og reducerede samlet set de vigtigste antioxidantenzymaktiviteter sammenlignet med vildtype (WT) mus. Behandling af TgAPP-mus med quercetin eller rutin øgede GSH/GSSG, formindskede MDA-niveauer og begunstigede enzymets antioxidantkapacitet, især med rutin. For det andet blev både APP-ekspression og BACE1-aktivitet formindsket med quercetin eller rutin i TgAPP-mus. Med hensyn til ADAM10 havde det en tendens til at stige i TgAPP-mus med rutinbehandling. Hvad angår caspase-3-udtryk, viste TgAPP en stigning, som var det modsatte med rutin. Endelig blev stigningen i ekspression af de inflammatoriske markører IL-1 og IFN- i TgAPP-mus sænket af både quercetin og rutin. Samlet tyder disse fund på, at rutin af de to flavonoider kan indgå i en daglig kost som en form for adjuverende terapi ved AD.

Klik på Antioxidant Cistanche Chemist Warehouse

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Nøgleord:quercetin; rutin; glutathion; APPswe; BACE1; Alzheimers sygdom

1. Introduktion

Nedgangen i kognitiv funktion er et grundlæggende klinisk neurodegenerationssymptom, der er strengt relateret til alder [1]. Ernæringens indvirkning på aldersrelateret kognitiv tilbagegang er et stadig mere voksende emne, da det er en vital faktor, som nemt kan modificeres. Patologiske ændringer i hjernen observeret under kognitiv tilbagegang finder sted i god tid før enhver klinisk manifestation, som for det meste forekommer i alderdommen. Dette giver en længere periode til at etablere forebyggelsesstrategier vedrørende aldersrelateret kognitiv tilbagegang og demens, som er et stort folkesundhedsproblem [2]. I mange år har der været udført intensiv forskning i forbindelser af naturlig oprindelse, som findes i daglige kostvaner, i kognitiv-forstærkende terapi [3].

En af de mest almindelige aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme er Alzheimers sygdom (AD), som er karakteriseret ved to neuropatologiske kendetegn: amyloid- (A ) plaques og neurofibrillære sammenfiltringer. Med hensyn til forskning på dyr kan dyremodeller simulere den asymptomatiske fase af AD ved at modificere A-precursorproteinet (APP), for eksempel [4,5].

Bemærkelsesværdigt er flere bioaktive fytokemikalier afledt af planter forbundet med forskellige sundhedsmæssige fordele og nedsat risiko for mange sygdomme blevet screenet for at danne ikke-kovalente komplekser med amyloid-(A)-peptidet [3].

Selvom adskillige traditionelle lægemidler og naturlige kostprodukter har vist store fremskridt i retning af modvirkning af AD-patologi, er vi fuldt ud klar over begrænsningerne ved AD-dyremodeller, da lovende virkninger af disse stoffer ikke altid kan kopieres i humane undersøgelser [6]. Men på grund af vanskeligheden ved at analysere hjernevæv hos mennesker, især i meget tidlige stadier af progression, er undersøgelser i gnavermodeller nødvendige. Som følge heraf kan disse eksperimentelle modeller understøtte udviklingen af ​​brugermidler fra traditionelle lægemidler og sikre naturlige forbindelser til at forsinke progressionen af ​​neurodegenerative sygdomme. Derfor bør testning af naturlige forbindelser, som findes i daglige diæter, til sygdomsforebyggelse og beskyttelse mod risikoen for AD, være en prioritet.

Blandt disse vigtige naturlige kostmidler er quercetin, som er den vigtigste polyfenoliske flavonoid i flere frugter og grøntsager [7]. Quercetin er hovedsageligt til stede i sin glycosidform, dvs. rutin. På sin side har rutin (quercetin-3-O-rutinosid) vist dybtgående virkninger på de forskellige cellulære funktioner, der understøtter adskillige patologiske tilstande, nemlig antimikrobielle, anticarcinogene, antitrombotiske, kardiobeskyttende og neurobeskyttende. Disse farmakologiske virkninger er hovedsageligt forbundet med rutins antiinflammatoriske og antioxidante aktiviteter. På grund af dets evne til at krydse blod-hjerne-barrieren og/eller dets metabolitter, er det blevet påvist, at rutin kan ændre både kognitive og adfærdsmæssige symptomer på neurodegenerative sygdomme [8].

Vores tidligere undersøgelser har fundet ud af, at både flavonoider, quercetin og rutin, påvirker forskellige signalveje og molekylære netværk forbundet med moduleringen af ​​proteasomfunktioner i neuroblastomceller [9]. Derudover er det blevet påvist, at BACE1-ekspression og APP-behandling er reguleret af ubiquitin-proteasom-vejen [10], og at tilskud med reduceret glutathion (GSH) beskyttede neuroner mod proteasomhæmning [11]. GSH-depletion i hjernen er et almindeligt fund hos patienter med neurodegenerative sygdomme, såsom AD, og ​​kan forårsage neurodegeneration før sygdomsdebut [12]. Ubiquitinering af BACE1 og blokering af ubiquitin-proteasom-vejen hæmmer BACE1-nedbrydning og fører følgelig til øget produktion af BACE1 enzymatisk aktivitet [10].

Baseret på disse resultater, og at kostvaner og kosttilskud kan påvirke den cellulære redoxstatus, sigtede vi på at undersøge virkningerne af en diæt indeholdende quercetin eller rutin på intracellulær redox-homeostase i hjernen (GSH/GSSG), dens korrelation med BACE1-aktivitet, og APP-ekspression i musemodeller af AD (bærende human svensk mutation Amyloid Precursor Protein APP transgen, APPswe).

Endelig, da der er overbevisende beviser for effekten af ​​flavonoidtilskud til at forbedre specifikke kognitive domæner og/eller MR-resultater [13], forsøgte vi at efterligne, hos dyr, en intervention ved at levere en sund kost indeholdende moderate mængder af en bestemt potentiel aktiv. ingrediens (quercetin eller rutin) som en effektiv strategi til at forhindre ekspression af AD-markører.

2. Resultater

2.1. Genotyping af mus

TgAPP-musekolonien blev udviklet i vores laboratorium fra Tg2576 heterozygote hanner og vildtype-hunner. Genotypebestemmelse af mus blev udført for at påvise transgene individer. Af alle de testede mus blev cirka 40 procent fundet at være transgene (TgAPP).

De opnåede PCR-produkter blev adskilt ved elektroforese i 1,5 procent agarosegeler i 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA) buffer ved 70 V (konstant spænding) og derefter afbildet ved farvning med GelRed (Millipore). Amplifikationsprofilen for både transgene og WT-mus er vist i figur 1.

2.2. Glutathion

For at evaluere intracellulær redox-homeostase i neuroner i TgAPP-mus blev GSH- og GSSG-niveauer kvantificeret, og GSH/GSSG-forholdet blev bestemt som en markør for cellulær-reducerende kraft hos både hanner og hunner (figur 2).

I vurderingen af ​​effekten af ​​transgenet på glutathionsystemet blev der observeret et fald i den cellulære reducerende kraft (GSH/GSSG) i TgAPP-musene vedrørende WT-dyr, hos både hanner og hunner og begge områder af hjernen (figur 2C3, H3), især i hippocampus. I både WT- og TgAPP-mus var GSH/GSSG-forholdet signifikant lavere hos hanner end hos hunner (figur 2C3, H3; p < 0.05). Mens dette fald hos TgAPP-hunner er resultatet af lavere GSH-niveauer (Figur 2C1, H1), tilskrives det hos TgAPP-mænd for det meste en stigning i GSSG-niveauer (Figur 2C2, H2).

Ændringer i GSH- og GSSG-niveauer af henholdsvis TgAPP-mus efter quercetin- eller rutinbehandling er mere fremtrædende hos hanner end hos hunner. Det ser ud til, at quercetin har en tendens til at øge GSH-niveauer (figur 2C1, H1; p < 0.05) og rutin til at sænke GSSG-niveauer (figur 2C2, H2; p < 0,05).

Quercetin- og rutinbehandlinger, hos både hanner og hunner, var i stand til at vende faldet i forholdet GSH/GSSG i hippocampus (figur 2H3), hvor genvindingen af ​​redoxkraft var signifikant i forhold til de ubehandlede TgAPP-mus. Hos hanner opnåede dette indeks lignende værdier som for WT-mus i hippocampus (H3). Hos hunner, selvom dette forhold ikke er hævet til det for WT-musene, forbedrede behandling med quercetin og rutin det betydeligt sammenlignet med det for TgAPP-musene i deres hippocampi (H3: quercetin, p < 0.{{ 6}}01; rutin, p < 0,05).

2.3. Thiobarbitursyre-reaktive stoffer (TBAR'er)

Niveauer af TBAR'er blev bestemt som en markør for lipidperoxidation. Ved hjælp af kalibreringskurver blev resultaterne udtrykt som malondialdehyd (MDA) koncentration (figur 3).

Efter APP-overekspression blev der observeret en signifikant stigning i MDA-niveauer sammenlignet med WT-mus i både cortex (figur 3C) og hippocampus (figur 3H) og hos både hanner og hunner (p < 0.001) .

Hos TgAPP-hunner genoprettede både quercetin- og rutinbehandlinger næsten MDA-niveauer til det samme som for WT-mus (figur 3C, H). Hos TgAPP-hanner genopretter både quercetin- og rutinbehandlinger ligeledes MDA-niveauer til det samme som for WT-mus i cortex (figur 3C) og reduceres endnu mere i hippocampus (figur 3H). I både WT- og TgAPP-mus, ubehandlede og flavonoiddiætbehandlede, var MDA-niveauer kønsafhængige (figur 3C, H; p < 0.05), bortset fra de quercetin-behandlede TgAPP-mus i hippocampus.

2.4. Enzymaktivitet og udtryk for antioxidantenzymer

For at tage stilling til, om regulering af den enzymatiske aktivitet eller genekspressionen af ​​de vigtigste antioxidantenzymer eller begge sker efter en quercetin- eller rutin-diæt, blev bestemmelse af den enzymatiske aktivitet og mRNA-niveauer udført.

Figur 4 viser enzymaktiviteterne af SOD, CAT, GR og GPx, bestemt i hun- og hanmus, i hjernebarken (figur 4a) og hippocampus (figur 4b).

Som en konsekvens af APP-overekspression blev der kun observeret et signifikant fald i CAT-aktivitet i TgAPP-mus sammenlignet med WT-mus i både cortex (Figur 4a(C2); p < 0.05) og hippocampus (figur 4b(H2); p < 0,05).

Quercetin-behandling frembragte ingen signifikant variation i enzymaktiviteter sammenlignet med TgAPP-mus, hos hanner eller hunner, i de undersøgte hjerneområder. I modsætning hertil oplevede dyr behandlet med rutin en stigning i CAT-aktivitet i cortex (figur 4a(C2)) og i GR-aktivitet i hippocampus (figur 4b(H3)) hos både hanner og hunner (p < 0 .05). Desuden øgede rutin hippocampus CAT-aktivitet hos TgAPP-mænd (figur 4b(H2)) og GPx-aktivitet hos kvinder (figur 4b(H4)).

Figur 5 viser genekspressionen af ​​de vigtigste antioxidantenzymer, SOD, CAT, GR og GPx, bestemt i hun- og hanmus, i hjernebarken (figur 5a) og hippocampus (figur 5b).

Ingen forskelle i genekspression mellem TgAPP- og WT-mus observeres for de vigtigste antioxidantenzymer (figur 5a,b). TgAPP-hanner behandlet med rutin viste en signifikant stigning i ekspressionen af ​​CAT i hippocampus (figur 5b(H2)). Hvad angår hippocampus GPx, blev der observeret et lignende mønster som CAT, selvom stigningen ikke var signifikant (figur 5b(H4)).

2.5. APP-behandling: BACE1 og ADAM10

Resultaterne af BACE1-enzymaktivitet i både cerebral cortex og hippocampus hos hanner og hunner er vist i figur 6, udtrykt som procenter af aktivitet vedrørende ubehandlede TgAPP-mus.

I figur 6 blev BACE1-enzymaktiviteten i TgAPP-mus fundet at stige med omkring 10 procent sammenlignet med WT-mus, i både hjerneområderne under undersøgelse og i begge køn, og blev fundet at være statistisk signifikant (p < 0,05).

Stigningen i aktivitet observeret i de transgene mus blev sænket af både quercetin- og rutinbehandlinger, både i cortex og i hippocampus. Ikke desto mindre kunne det stadig bemærkes, at rutin-effekten var lidt større end hos quercetin hos mænd.

Da aktiviteten af ​​BACE1 var kendt, besluttede vi at udføre genekspressionsundersøgelsen af ​​APP, hovedkarakteristikken for den transgene dyremodel, og dens vigtigste processeringsenzymer: BACE1 og ADAM10. Figur 7 viser resultaterne opnået i hun- og hanmus, både i cortex og hippocampus.

Hos begge køn blev en signifikant stigning i APP-ekspression på mere end 85 procent observeret vedrørende WT-mus, hvilket viser overekspressionen af ​​genet både i hjernebarken (figur 7C1; p < 0.05) og i hippocampus (figur 7H1; p < 0.05). Behandlinger med quercetin og rutin var i stand til at reducere dette udtryk med mere end 45 procent (p < 0,05) for både han- og hunmus i begge hjerneområder under undersøgelse (figur 7C1, H1), hvor virkningerne var mere fremtrædende i hippocampus ( figur 7H1).

Hvad angår BACE1-proteinekspressionen, selvom BACE1-aktiviteten var ændret, var der ingen signifikante forskelle mellem transgene og ikke-transgene mus uanset køn og undersøgt flavonoidbehandling.

Således evaluerede vi ADAM10-ekspressionen involveret i den ikke-amyloidogene behandling af APP. Selvom ændringerne i ADAM10-ekspression i TgAPP-mus i sammenligning med WT-mus ikke var statistisk signifikante, blev der observeret et lille fald. Med hensyn til flavonoidbehandlinger viste rutin en stigende tendens i ADAM10-ekspression, både hos mænd og kvinder og i begge områder af hjernen (figur 7C3, H3).

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】