En 13-uges subkronisk toksicitetsundersøgelse af 2-(l-menthoxy)ethanol i F344-rotter

Introduktion

2-(1-menthoxy)ethanol (CAS-nr. 38618-23-4) er en klar og farveløs væske med en karakteristisk lugt og er meget udbredt som smagsstof. Den Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA) har evalueret 2-(L-methoxy)ethanol som smagsstof, kategoriseret som stoffer, der er strukturelt relateret til menthol1. Baseret på den strukturelle klasse af smagsstoffer, 2-(L-methoxy)ethanol blev tildelt klasse I. I USA og Europa er indtagelsesniveauerne for 2-(L-methoxy)ethanol af mennesker blev estimeret til at være henholdsvis 12 ug/person/dag og 0,01 ug/person/dag, begge under klasse I-tærsklen på 1.800 ug/person/dag. Baseret på disse estimater anses det for, at 2-(1-menthoxy)ethanol giver muligvis ikke sikkerhedsproblemer under rutinemæssig brug som smagsstof.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg kropsvægt [BW])1. På trods af brugen af ​​2-(1-menthoxy)ethanol som smagsstof, er der begrænsede data tilgængelige vedrørende toksiciteten ved gentagen dosering af denne forbindelse. Vores laboratorium har undersøgt toksiciteten af ​​adskillige fødevaretilsætningsstoffer, herunder repræsentative smagsstoffer fra hver kategori, i gnavermodeller 2-7. For at afklare den toksikologiske profil og etablere et niveau for ingen observeret negativ effekt (NOAEL) udførte vi en 13-uges subkronisk toksicitetsundersøgelse af 2-(1-menthoxy)ethanol, som var oralt indgivet til F344-rotter ved sondemad.

Materialer og metoder

Testkemikalie

2-(1-menthoxy)ethanol (lot nr. 5I0002, renhed 99,9%) produceret af Takasago Int. Corp. (Tokyo, Japan) blev leveret af Division of Standards and Evaluation, Department of Food Safety, Ministry of Health, Labor and Welfare, Japan, med støtte fra Japan Flavor & Fragrance Materials Association (Tokyo, Japan). Selvom teststoffet blev leveret som en blanding af optiske isomerer (CAS-nr. 38618-23-4), blev det bekræftet som l-enantiomeren (CAS-nr. 75443-64-0) ​​af producenten. Oral sondeernæring med majsolie (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) som vehikel blev valgt som indgivelsesvej på grund af den vandige uopløselighed og flygtighed af 2-(1-menthoxy)ethanol. Opløsninger af 2-(1-menthoxy)ethanol blev fremstillet dagligt umiddelbart før administration. Efter opbevaring i 2 timer ved stuetemperatur blev de resterende forhold mellem 2-(1-menthoxy) ethanol i 4, 40 og 400 mg/ml opløsning bekræftet som 96,8 %, 99,8 % og 96,5 % ved gaskromatografi (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokyo, Japan).

Forsøgsdyr

I alt blev 40 specifikke patogenfrie han- og 40 hunrotter (F344/DuCrlCrlj, 5 uger) købt fra Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) og brugt efter akklimatisering i en uge. Under undersøgelsen blev dyrene anbragt i polycarbonatbure med blødt strøelse, holdt i et rum med et barrieresystem for at kontrollere lys/mørke-cyklussen (12 timer), ventilation (luftudvekslingshastighed på 18 gange/t), temperatur ( 24 ± 1 grad) og relativ luftfugtighed (55 ± 5%). Burene og spånestrøelsen blev udskiftet to gange om ugen. Hvert dyr havde fri adgang til postevand og en basal diæt (CRF-1; Orientalsk gær, Tokyo, Japan). I begyndelsen af ​​forsøget blev dyrene tilfældigt fordelt til fire grupper på 10 han- og hunrotter hver, baseret på kropsvægte målt umiddelbart før påbegyndelse af behandling med testkemikaliet.

Studere design

I en foreløbig {{0}}-dages undersøgelse, der vurderede 2-(1-menthoxy) ethanol indgivet i doser på 0, 200, 400 og 800 mg/kg lgv/ dag, var absolutte og relative levervægte signifikant øget i alle behandlede grupper af begge køn (data ikke vist). Baseret på disse resultater valgte vi 2-(1-menthoxy) ethanoldoser på 0, 15, 60 og 250 mg/kg lgv/dag til administration til både han- og hunrotter i det nuværende {{ 13}}ugers toksicitetsundersøgelse.

Generelle forhold og dødelighed blev vurderet dagligt. Kropsvægten såvel som mængden af ​​tilført foder og restdiæt blev målt en gang om ugen i forsøgsperioden. Alle rotter blev fastet natten over efter endt behandling, og blodprøver til hæmatologi og serumbiokemi blev opsamlet fra abdominalaorta under dyb inhalationsanæstesi under anvendelse af isofluran. Undersøgelsesdesignet var af Japans retningslinjer for betegnelse for fødevaretilsætningsstoffer og revision af standarder for brug af fødevaretilsætningsstoffer (1996) og godkendt af Animal Care and Utilization Committee under National Institute of Health Sciences, Japan.

Hæmatologi og serumbiokemi

Følgende hæmatologiske parametre blev analyseret ved hjælp af ProCyte Dx automatiske hæmatologianalysatorer (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA): antal hvide blodlegemer (WBC), antal røde blodlegemer (RBC), hæmoglobinkoncentration (HGB), hæmatokrit (HCT), gennemsnitlig korpuskulært volumen (MCV), gennemsnitlig korpuskulær hæmoglobin (MCH), gennemsnitlig korpuskulær hæmoglobinkoncentration (MCHC), blodpladetal (PLT) og differentielle leukocytceller, herunder neutrofiler (Neut), lymfocytter (lymfe), monocytter (mono), eosinofiler (Eosino) og basofiler (Baso). Serum biokemisk analyse blev udført af Oriental Yeast for følgende parametre: totalt protein (TP), albumin (Alb), albumin/globulin-forhold (A/G), total bilirubin (Bil), glucose, total kolesterol (T-Chol), triglycerid (TG), urinstofnitrogen (BUN), kreatinin (Cre), calcium (Ca), uorganisk fosfor (IP), natrium (Na), kalium (K), klor (Cl), aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), alkalisk phosphatase (ALP) og -glutamyl transpeptidase (-GTP).

Organvægte og histopatologisk vurdering

En fuldstændig obduktion blev udført for alle dyr, og hjerne, thymus, lunger, hjerte, milt, lever, binyrer, nyrer, testikler og æggestokke blev vejet. Disse organer, såvel som væv fra rygmarven, trigeminusnerven, hypofysen, næsehulen, spytkirtlerne, tungen, spiserøret, luftrøret, aorta, skjoldbruskkirtlen, biskjoldbruskkirtlen, bugspytkirtlen, maven, tynd- og tyktarmen, submandibulær og mesenterisk lymfeknuder, vagina, livmoder, urinblære, prostata, sædblærer, epididymis, lårben og brystben med knoglemarv, ryghvirvler, skeletmuskler, iskiasnerve, hud og mælkekirtel, blev fikseret i 10 % neutral-pufret formalin; derefter blev paraffinindlejrede snit fremstillet og farvet med hæmatoxylin og eosin til histopatologisk undersøgelse. Testiklerne og øjnene med Harderian-kirtler blev fikseret i henholdsvis Bouins fikseringsmiddel og Davidsons opløsning. Knoglevæv, inklusive næsehulen, ryghvirvler, brystben og lårben, blev afkalket under anvendelse af en blanding af 10 % myresyre og 10 % bufret formalin i op til 2 uger. Histopatologisk vurdering blev udført for alt væv opnået fra dyr i kontrolgruppen, og gruppen administrerede den højeste dosis, medmindre der blev observeret nogen behandlingsrelaterede læsioner.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF IMMUNITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Immunhistokemi for 2u-globulin

Hos hanrotter blev akkumulering af 2u-globulin i nyren undersøgt ved immunhistokemisk analyse af paraffinindlejrede snit. Til antigenudvinding blev sektionerne opnået fra 5 rotter i hver gruppe inkuberet med proteinase K (DAKO, Glostrup, Danmark) i 1 minut ved stuetemperatur. Alle sektioner blev nedsænket i 3% H2O2/methanolopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur for inaktivering af endogen peroxidaseaktivitet. Efter blokering af uspecifikke reaktioner med 10% normalt kaninserum blev sektionerne inkuberet med et primært antistof for 2uglobulin (fortyndet 1:400; anti-rotte 2u-globulin antistof; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) natten over ved 4 grader 8. Visualisering af antistofbinding blev udført under anvendelse af et VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og 3,3'-diaminobenzidin. Alle sektioner blev modfarvet med hæmatoxylin.

Statistisk analyse

Varianser i dataværdier for kropsvægt i løbet af forsøgsperioden, såvel som for hæmatologi, serumbiokemi og organvægte, blev vurderet for homogenitet ved hjælp af Bartletts test. Envejsvariansanalyse og Kruskal-Wallis-testen blev henholdsvis anvendt til homogene og heterogene data. Ved bestemmelse af statistisk signifikante forskelle blev Dunnetts multiple sammenligningstest brugt til at sammenligne kontrol- og behandlingsgrupper. Sammenligninger af histopatologiske forekomster og karakterer blev analyseret ved at bruge henholdsvis Fishers eksakte sandsynlighedstest og Mann-Whitneys U-test. P værdier af<0.05 were considered statistically significant.

Resultater

In-life parametre, hæmatologi og serum biokemi

Ingen signifikante kliniske tegn blev noteret i hele forsøgsperioden, og alle dyr overlevede indtil den planlagte obduktion. Endvidere blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i kropsvægt og daglig fødeindtagelse hos han- og hunrotter (fig. 1A og B).

Hæmatologi- og serumbiokemidata er vist i henholdsvis tabel 1 og 2. Hæmatologiske analyser afslørede signifikant nedsat HGB, HCT, MCV og MCH og øget PLT hos hanrotter, der fik administreret 250 mg/kg lgv/dag 2-(1-menthoxy)ethanol (tabel 1). I serumbiokemi blev signifikante stigninger i TP, T-Chol og Ca og fald i Bil og ALP noteret hos mænd i 250 mg/kg-gruppen (tabel 2). En signifikant stigning i Cre og et fald i A/G blev noteret hos mænd i 60 og 250 mg/kg grupperne. Hos kvinder blev der registreret en signifikant stigning i Ca og et fald i ALP i 60 og 250 mg/kg grupperne, hvorimod forhøjet T-Chol og reduceret A/G, Bil, TG, AST og ALT blev påvist i 250 mg. /kg gruppe. Selvom en signifikant stigning i TG og et fald i Cl blev observeret hos mænd, der fik 60 mg/kg, antydede manglen på et dosisforhold, at disse forskelle ikke var forbundet med eksponering for teststoffet.

Organvægte

Data for organvægte er opsummeret i tabel 3. Absolutte og relative levervægte var signifikant forøget hos begge køn i 250 mg/kg-gruppen (tabel 3). En signifikant stigning i relative levervægte blev observeret hos mænd i 60 mg/kg-gruppen. Hos mænd var den absolutte og relative nyrevægt signifikant øget i grupperne på 60 og 250 mg/kg. I den mandlige 250 mg/kg-gruppe blev der observeret signifikante stigninger i absolutte og relative vægte af binyrer og relative vægte af milt og testikler.

Histopatologi og immunhistokemi

Data for histopatologiske og immunhistokemiske fund er opsummeret i henholdsvis tabel 4 og 5. Histopatologiske fund afslørede, at hyppigheden af ​​akkumulering af eosinofile granula (fig. 2A-D), basofile tubuli og hyalingips samt fokal interstitiel inflammation i nyren, var signifikant øget i behandlingsgrupper udelukkende hos mænd sammenlignet med kontrolgruppen. gruppe (tabel 4). Baseret på immunhistokemiske analyser viste hanrotter behandlet med teststoffet en stigning i 2u-globulin-immunreaktivitet i epitelceller i proksimale tubuli, hvilket viser en klar dosisafhængighed (fig. 2E-H) (tabel 5).

Ved obduktion viste en hanrotte i 250 mg/kg-gruppen alvorlig forstørrelse af højre nyre på grund af et histologisk karakteristisk nefroblastom. Selvom nefroblastom er ualmindeligt i de fleste rottestammer9, blev dette tilfælde betragtet som tilfældigt, da ingen andre dyr havde lignende læsioner. I orale karcinogenicitetsundersøgelser har forekomsten af ​​spontant nefroblastom hos F344/DuCrlCrlj hanrotter desuden været mellem 0-2,0 %10. Selvom adskillige læsioner sporadisk blev påvist i andre organer, var der ingen signifikante behandlingsafhængige ændringer i forekomsten af ​​disse læsioner.

Diskussion

Til dato er 24 smagsstoffer, inklusive 2-(1-menthoxy) ethanol, blevet vurderet af JECFA som stoffer, der er strukturelt relateret til menthol, og alle er opført som "ingen sikkerhedsproblemer" på de nuværende estimerede niveauer af indtag1, 11. 2-(1-Menthoxy)ethanol er klassificeret i en undergruppe af alicykliske alkoholer eller ethere og anses for primært at være konjugeret med glucuronsyre, efterfulgt af urinudskillelse1. Selvom orale LD50-værdier af disse stoffer i gnavere er relativt høje, er data fra toksicitetsundersøgelser med gentagne doser fortsat begrænsede. En 13-ugers toksicitetsundersøgelse med gentagne doser har afsløret, at menthylpyrrolidoncarboxylat (CAS-nr. 68127-22-0), en forbindelse, der er strukturelt relateret til menthol, kan være forbundet med øget relativ lever- og nyrevægt hos mænd og kvinder Wistar rotter. Akkumulering af 2u-globulin i de proksimale tubuli hos hanrotter blev også observeret ved en dosis på 1.111 mg/kg lgv/dag, og NOAEL blev bestemt til 109 mg/kg lgv/dag1.

I den nuværende 13-ugers subkroniske toksicitetsundersøgelse af 2-(1-menthoxy)ethanol blev der ikke observeret toksikologiske ændringer i generel tilstand, kropsvægt og fødeindtagelse. Efter hæmatologisk vurdering observerede vi et fald i HGB (96,6 % til kontrolmiddelværdierne), HCT (96,3 %), MCV (98,4 %) og MCH (98,2 %) og en stigning i PLT (111 %) hos mænd 250 mg/kg gruppe, som blev anset for at være toksikologiske påvirkninger af 2-(1-menthoxy)ethanolbehandling. Både den absolutte (115 % hos begge køn) og den relative (119 % hos mænd og 111 % hos kvinder) levervægte var signifikant øget hos begge køn i 250 mg/kg-grupperne. Selvom der ikke var nogen histopatologiske ændringer i leveren, øgede niveauer af serum T-Chol (110 % hos mænd og 121 % hos kvinder) og TP (105 % hos mænd) og en reduktion i TG (60,1 % hos kvinder) hos de 250 mg/kg grupper indikerer toksiske ændringer forbundet med lipidmetabolisme og proteinsyntese i leveren. Reduceret HGB og MCH og forhøjet PLT, T-Chol og TP hos mænd og nedsat TG og øget absolut og relativ levervægt hos begge køn blev også påvist, med statistisk signifikans i 28-dagens foreløbige undersøgelse (data ikke vist ), hvilket bekræfter, at disse ændrede hæmatologiske og serumbiokemiske parametre, såvel som levervægte, ikke var tilfældige, men teststofrelaterede effekter. I modsætning hertil var den signifikante stigning i relative levervægte påvist i den mandlige 60 mg/kg-gruppe i denne undersøgelse ikke ledsaget af en stigning i absolutte vægte eller ændringer i relaterede biokemiske parametre, hvilket tyder på, at denne stigning var en adaptiv ændring.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Signifikant øget absolut (120 %) og relativ (118 %) vægt af binyrer i den mandlige 250 mg/kg-gruppe blev anset for at være forbundet med testkemikaliet. Desuden viste øgede absolutte og relative vægte af binyrer hos begge køn en klar dosisafhængighed i 28-dagens foreløbige undersøgelse (data ikke vist), hvilket indikerer sammenhængen med testkemisk behandling. Selvom binyrehypertrofi kunne skyldes stress, var der ingen fund, der tydede på stress, såsom reduceret vægtøgning eller atrofi af thymus og andre lymfoide organer, i både de nuværende og foreløbige undersøgelser. Da der muligvis ikke er nogen histopatologiske ændringer i binyrerne, selv ved nedsat glukokortikoidproduktion i tilfælde af hæmning af steroidogenese-relaterede enzymer12, kan muligheden for, at den øgede binyrevægt er et toksisk fund, ikke udelukkes. I modsætning hertil blev øget relativ vægt af milten og testiklerne i den mandlige 250 mg/kg-gruppe, som ikke blev observeret i det foreløbige studie, betragtet som toksikologisk insignifikant på grund af fraværet af histopatologiske læsioner eller signifikant øgede absolutte vægte. Tilsvarende afslørede serumbiokemi et fald i A/G og en stigning i Ca hos begge køn, som ikke blev anset for at have nogen toksikologisk betydning, da der ikke blev påvist abnormiteter i relaterede parametre. Desuden var faldende Bil- og ALP-niveauer hos begge køn og nedsat ASAT og ALAT hos kvinder i modsætning til forventede toksiske virkninger og blev anset for at være uden betydning.

Kronisk nefropati karakteriseret ved basofile tubuli, hyalingips og fokal interstitiel inflammation blev observeret med statistisk signifikans hos mænd i alle behandlede grupper. Derudover blev øget serum Cre og absolut og relativ nyrevægt påvist i mandlige 60 og 250 mg/kg grupper; disse ændringer blev ikke observeret i kvindelige behandlingsgrupper. I disse tilfælde blev graden af ​​akkumulering af eosinofile granula i proksimale tubulære epitelceller øget på en tilsyneladende dosisafhængig måde. Disse granula blev bekræftet som 2u-globulin ved immunhistokemi, hvilket indikerer forekomsten af ​​2u-globulin nefropati. 2u-globuliner bundet til visse kemikalier, såsom d-limonen, akkumuleres i lysosomer og observeres i de proksimale tubuli som eosinofile eller hyaliske granulater9. Denne ophobning kan beskadige epitelceller, hvilket fører til kronisk progressiv nefropati og deraf følgende tumordannelse9. Selvom NOAEL for 2-(1-menthoxy)ethanol associeret med 2u-globulin nefropati i hanrottenyrer ikke blev identificeret, er denne type nefropati angiveligt specifik for hanrotter og derfor ikke relevant for mennesker risikovurdering 13. En øget risiko for nyresvigt medieret via mekanismer relateret til 2u-globulinakkumulering er højst usandsynlig, da dette protein er fraværende hos mennesker14. Det blev derfor anset for rimeligt at udelukke ændringer forbundet med kronisk nefropati observeret hos mænd fra bestemmelsen af ​​NOAEL.

Som konklusion viste den nuværende 13-uges subkroniske toksicitetsundersøgelse, at 250 mg/kg lgv/dag 2-(1-menthoxy) ethanolbehandling forårsagede toksiske ændringer i hæmatologi, serumbiokemi og organvægt hos han- og hunrotter F344. Baseret på de observerede resultater, NOAEL for 2-(1-menthoxy)ethanolblev vurderet til 60 mg/kg lgv/dag for begge køn.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA TIL FORBEDRING AF SEKSUEL FUNKTION PHGS75% ECH 30% ACT 12%